青蒿AaGTD1基因及其編碼的蛋白與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種青蒿中控制青蒿素合成和腺毛發(fā)育的AaGTDI基因及其編碼的蛋白與在制備青蒿素中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 瘧疾是一種全球性疾病，它威脅著全世界約一半人口的健康。2010年約有2. 19億 瘧疾病例，有66萬人死亡。據(jù)WHO2013年報(bào)道，99個(gè)國家和地區(qū)有持續(xù)性的瘧疾傳播。來 自無瘧疾地區(qū)的無免疫力旅客在感染后病情會特別嚴(yán)重。對于瘧疾特別是惡性瘧現(xiàn)有的最 佳治療方法，是以青蒿素為基礎(chǔ)的聯(lián)合療法。青蒿素是一種合成于我國藥用植物青蒿腺毛 的倍半萜內(nèi)酯過氧化物，而且青蒿是青蒿素的唯一天然來源。對于這種每年銷售額超過億 次治療的藥物，青蒿素聯(lián)合療法的供應(yīng)仍然依賴于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的青蒿素。因此，如何最大限度 的提高青蒿素產(chǎn)量，越來越成為人們研宄的重中之重。優(yōu)良青蒿品種的培育，不僅能降低青 蒿素的成本、穩(wěn)定供應(yīng)，而且能提高農(nóng)民農(nóng)作物的種植信心。
[0003] 青蒿是主產(chǎn)于我國的一種常見的菊科蒿屬的一年生草本植物，20世紀(jì)70年代其 提取物青蒿素被發(fā)現(xiàn)在抗瘧方面與傳統(tǒng)的奎寧類抗瘧藥物具有不同的作用機(jī)理且療效顯 著。目前以青蒿素為基礎(chǔ)的藥劑已成為全球治療皰疾的首選藥物。青蒿素及其衍生物不僅 對瘧疾等寄生蟲疾病有著重要的作用，同時(shí)還具有抗炎、抗血吸蟲、抗腫瘤以及免疫調(diào)節(jié)的 功能，對乳腺癌、紅斑狼瘡、風(fēng)濕等有顯著療效。開發(fā)青蒿素及其衍生物的其它用途將進(jìn)一 步增大青高素的需求。
[0004] 腺毛是青蒿素體內(nèi)合成、分泌、積累及儲存的場所。青蒿的葉和莖上面布滿了這種 腺毛，目前所知道的參與青蒿素合成代謝途徑的基因都在腺毛中表達(dá)。青蒿素和一些其他 生物活性物質(zhì)對植物本身有很高的毒性，所以將其扣押在或者分泌出合成部位就顯得非常 重要，腺毛的表皮下空間很可能就是青蒿扣押青蒿素和其它植物毒性物質(zhì)的場所。
[0005] 腺毛是毛狀體的一種，毛狀體是許多植物葉片和其它器官表面的小突起結(jié)構(gòu)，它 們可以分為兩大類：有腺體的和無腺體的。青蒿的腺毛由10個(gè)細(xì)胞組成，包括兩個(gè)基底細(xì) 胞，兩個(gè)莖細(xì)胞，6個(gè)分泌細(xì)胞，還有頂部的表皮下空間。其中青蒿素主要在位于外側(cè)的兩個(gè) 分泌細(xì)胞合成，然后分泌到并儲存于腺毛最外面的表皮下空間，而內(nèi)側(cè)的兩對分泌細(xì)胞含 有葉綠素，具有其它功能。毛狀體的最大特征就是他們能夠合成，儲存，有時(shí)候還能分泌大 量特定的代謝產(chǎn)物，包含多種類型的萜烯，苯丙烷衍生物，酰基糖，甲基酮和類黃酮。許多毛 狀體產(chǎn)生的化合物具有重要的醫(yī)藥，香料，食品添加劑，天然殺蟲劑等商業(yè)價(jià)值。近年來將 腺毛開發(fā)成"化學(xué)工廠"來生產(chǎn)高價(jià)值的植物產(chǎn)物引起了植物生物技術(shù)專家的關(guān)注。
[0006] 同時(shí)，由于植物表達(dá)體系的方便、廉價(jià)等有點(diǎn)，利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)藥用蛋白越來 越受重視，并迅猛發(fā)展，已有100余種蛋白得到表達(dá)，有些已進(jìn)入商業(yè)化生產(chǎn)。因此，從青蒿 中分離出參與青蒿腺毛發(fā)育和青蒿素合成的基因有重大意義，在藥物研發(fā)及農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上有 重要作用。
[0007] 中國專利申請CN201410374611. 2,發(fā)明名稱為"青蒿AaMYBLl蛋白編碼序列及 其應(yīng)用"，申請公布號為CN104152463A，公開了一種青蒿MYB-like類轉(zhuǎn)錄因子編碼序列AaMYBLl，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將青蒿AaMYBLl轉(zhuǎn)錄因子干擾載體轉(zhuǎn)化青蒿可以有效調(diào)控青蒿 表皮的腺毛密度，從而提高青蒿素的含量。
[0008] 中國專利申請CN201410278312. 9,發(fā)明名稱為"一種轉(zhuǎn)iaaM基因提高黃花蒿中青 蒿素含量的方法"，申請公布號為CN104059940A，公開了一種構(gòu)建iaaM基因在黃花蒿腺毛 細(xì)胞特異表達(dá)的載體，利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化黃花蒿，以提高黃花蒿中青蒿素含量的 方法。
[0009] 中國專利CN201110344258.X，發(fā)明名稱為"青蒿bHLH轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因與應(yīng) 用"，申請公布號為CN102372769A，公開了一種青蒿bHLH轉(zhuǎn)錄因子，將bHLH轉(zhuǎn)錄因子瞬時(shí)轉(zhuǎn) 化到青蒿植株內(nèi)過表達(dá)，其所調(diào)控的青蒿素生物合成代謝中的關(guān)鍵酶表達(dá)量大幅度提高， 可以用來生產(chǎn)青蒿素。
[0010] 經(jīng)對現(xiàn)有技術(shù)的文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，尚未有關(guān)青蒿AaGTDl基因及其編碼的蛋白的報(bào) 道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種青蒿中控制青蒿素合成和腺 毛發(fā)育的AaGTDl基因及其編碼的蛋白，本發(fā)明的另一目的在于提供AaGTDl基因及其編碼 的蛋白在制備青蒿素中的應(yīng)用。
[0012] 本發(fā)明是通過以下的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，
[0013] 本發(fā)明的第一方面，提供了一種青蒿AaGTDl基因，其核苷酸序列如SEQIDNO: 1 所示。
[0014] 所述的青蒿AaGTDl基因，其核苷酸序列為543bp。
[0015] 本發(fā)明的第二方面，提供了一種青蒿AaGTDl基因編碼的蛋白，其氨基酸序列如 SEQIDN0:2 所示。
[0016] 所述的青蒿AaGTDl基因編碼的蛋白，其氨基酸序列為180aa。
[0017] 本發(fā)明的第三方面，提供了一種青蒿AaGTDl基因的表達(dá)盒、重組表達(dá)載體、重組 菌或轉(zhuǎn)基因植物。
[0018] 所述的青蒿AaGTDl基因的表達(dá)盒、重組表達(dá)載體、重組菌或轉(zhuǎn)基因植物中，用于 擴(kuò)增青蒿AaGTDl基因全長的引物對，所述的引物對中，一條引物序列如SEQIDN0:3所示， 另一條引物序列如SEQIDN0:4所示。
[0019] 所述的青蒿AaGTDl基因的表達(dá)盒、重組表達(dá)載體、重組菌或轉(zhuǎn)基因植物中，所述 的重組表達(dá)載體為質(zhì)粒PHB_35SX2-AaGTDl。
[0020] 所述的青蒿AaGTDl基因的表達(dá)盒、重組表達(dá)載體、重組菌或轉(zhuǎn)基因植物中，所述 的重組菌，即宿主細(xì)胞，為大腸桿菌、農(nóng)桿菌等。
[0021] 所述的青蒿AaGTDl基因的表達(dá)盒、重組表達(dá)載體、重組菌或轉(zhuǎn)基因植物中，所述 的轉(zhuǎn)基因植物為轉(zhuǎn)基因黃花蒿。
[0022] 本發(fā)明的第四方面，提供了青蒿AaGTDl基因、青蒿AaGTD1基因編碼的蛋白，以及 青蒿AaGTDl基因的表達(dá)盒、重組表達(dá)載體、重組菌或轉(zhuǎn)基因植物，在制備青蒿素中的應(yīng)用。
[0023] 進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了青蒿AaGTDl基因編碼的蛋白在作為轉(zhuǎn)錄因子的應(yīng)用。
[0024] 本發(fā)明的AaGTDl基因編碼的蛋白是一個(gè)AP2/ERF類的轉(zhuǎn)錄因子，AaGTDl基因表 達(dá)在青蒿幼嫩葉片和花苞中，參與了青蒿腺毛的發(fā)育和青蒿素的合成，因此可以用來生產(chǎn) 新的高青蒿素含量的青蒿品系，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上具有十分重要的應(yīng)用。
[0025] 所述的應(yīng)用，具體是：通過轉(zhuǎn)基因方法提高植物組織中青蒿AaGTDl基因的表達(dá) 量；
[0026] 所述的應(yīng)用，具體是：青蒿AaGTDl基因在提高植物組織中與促進(jìn)青蒿素合成相關(guān) 的酶的編碼基因的表達(dá)量中的應(yīng)用，所述的促進(jìn)青蒿素合成相關(guān)的酶的編碼基因是ADS、 CYP71AV1，或DBR2
[0027] 所述的植物為黃花蒿。
[0028] 本發(fā)明的第五方面，提供了一種提高黃花蒿中青蒿素含量的方法，包含以下步 驟：
[0029]A、構(gòu)建青蒿AaGTDl基因的重組表達(dá)載體；優(yōu)選的，是將如SEQIDNO: 1所示的 AaGTDl基因連于植物表達(dá)調(diào)控序列上，構(gòu)建含重組的植物表達(dá)載體；
[0030] B、將步驟A的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞農(nóng)桿菌，優(yōu)選的宿主細(xì)胞為農(nóng)桿菌 H1105;并將其轉(zhuǎn)化青蒿的愈傷組織；
[0031] C、通過抗生素篩選得到轉(zhuǎn)化成功的青蒿細(xì)胞，并培育使之長成完整植株；所得的 轉(zhuǎn)基因植株中青蒿素含量得到提高。
[0032] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的有益效果：本發(fā)明的AaGTDl基因編碼的蛋白 可以用來生產(chǎn)新的高青蒿素含量的青蒿品系，在青蒿素的獲得和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上具有十分重要 的應(yīng)用；此外，該基因編碼一個(gè)AP2/ERF類的轉(zhuǎn)錄因子，能夠與青蒿素合成路徑中的關(guān)鍵酶 基因ADS，CYP71AV1的啟動子相結(jié)合，并調(diào)控ADS，CYP71AV1基因的表達(dá)，從而調(diào)控青蒿素的 合成。細(xì)胞生物學(xué)分析表明抑制AaGTDl基因的表達(dá)可以使青蒿的分泌型和非分泌型腺毛 都發(fā)育異常，因此AaGTDl基因也參與了青蒿腺毛的發(fā)育，并起到了非常重要的作用。
【附圖說明】
[0033] 圖lAaGTDl基因的結(jié)構(gòu)域示意圖。
[0034] 圖2RT-PCR顯示AaGTDl基因的時(shí)空表達(dá)模式，其中A為AaGTDl基因在根、莖、老 葉、嫩葉、幼嫩花苞、成熟花苞及花中的表達(dá)情況。B為AaGTDl基因在