青蒿植株從上到下的 葉片中的表達(dá)情況。
[0035] 圖3AaGTDl蛋白特異的定位在細(xì)胞的細(xì)胞核，其中A-D為AaGTDl-GFP蛋白特異表 達(dá)在細(xì)胞核，E-H為空白GFP蛋白的表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)，A、E顯示GFP的綠光，B、F為葉綠體的 紅光，C、G為綠光和紅光合并在一起，D、H是綠光、紅光、白光合并在一起。
[0036] 圖4AaGTDl基因蛋白全長在pGEX-4t-l載體中表達(dá)，其中1為沉淀溶液，2為純化 前上清，3為GST柱子純純化前上清，箭頭所指為AaGTDl蛋白，M為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)。
[0037] 圖5AaGTDl基因在青蒿中過表達(dá)的植物表達(dá)載體PHB-35SX2-AaGTDl的構(gòu)建示意 圖。
[0038] 圖6在青蒿中抑制AaGTDl表達(dá)可使青蒿分泌型和非分泌型腺毛都發(fā)育異常。
[0039]圖7青蒿中過表達(dá)AaGTDl基因可以使青蒿素合成代謝路徑中多個(gè)基因的表達(dá)上 調(diào)。
[0040] 圖8青蒿中過表達(dá)AaGTDl基因可以使青蒿素含量增高，其中A-C為葉子中的含 量，D-F為花苞中含量，A、D為青蒿素，B、E為青蒿酸，C、F為二氫青蒿酸。
【具體實(shí)施方式】
[0041] 現(xiàn)結(jié)合實(shí)施例和附圖，對本發(fā)明作詳細(xì)描述，但本發(fā)明的實(shí)施不僅限于此。
[0042] 本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得或可按文獻(xiàn)方法制備。下列實(shí)施例中未注明 具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人《分子克隆：實(shí)驗(yàn)室指南》（New York:ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989)中所述的條件，或按照常規(guī)條件，或 按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。
[0043] 實(shí)施例1 :青蒿AaGTDl基因的克隆
[0044] 1.青蒿基因組總RNA的提取
[0045] 取適量新鮮的青蒿葉片于液氮中迅速研磨成粉末，再取約l〇〇mg粉末加入預(yù)先裝 有植物組織裂解液的1.5mlEP管中，充分振蕩混勻，然后按照TIANGENRNApr印Pure植物 總RNA提取試劑盒的說明書提取青蒿總RNA。用甲醛變性膠電泳鑒定RNA的質(zhì)量，然后在分 光光度計(jì)上測定RNA濃度。
[0046] 2?青蒿AaGTDl基因的克隆
[0047] 以所提取的總RNA為模板，利用全式金TansScriptFirst-StrandcDNA SynthesisSupermix試劑盒合成青蒿cDNA。
[0048] 根據(jù)AaGTDl基因的序列設(shè)計(jì)基因特異性引物：
[0049]正向（F) :CTTTACCATCACTTCCCTCT(SEQIDN0:3)
[0050]反向（R) :CCTTGGATGAGATACACTGTC(SEQIDN0:4)。
[0051] PCR反應(yīng)體系及條件如下：模板（cDNA) 1yL，正反向引物各1. 5yL，EasyPfuDNA PolymeraselyL，10XEasyPfuBuffer5uL，2.5mMdNTPs5yL，去離子水 35yL，構(gòu)成 50yL反應(yīng)體系。反應(yīng)條件為預(yù)變性：94°C4min，變性：94°C30sec，退火：50°C30sec，延伸： 72°C50sec繼續(xù)延伸：72°C10min，其中變性-退火-延伸經(jīng)歷35個(gè)循環(huán)。
[0052] 獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳、膠回收、連接、轉(zhuǎn)化，過夜培養(yǎng)后，挑單克隆，然后菌檢、 測序、比對，最后獲得青蒿中AaGTDl基因的全長編碼序列（SEQIDN0:1)，利用NCBI的 ORFfinder功能推導(dǎo)出其蛋白編碼序列（SEQIDN0:2)，其中，起始密碼子為ATG，終止密碼 子為TGA。米用SMART(http://smart,embl-heidelberg.de/)軟件，預(yù)測出AaGTDl蛋白的 包含一個(gè)AP2結(jié)構(gòu)域，是一個(gè)AP2/ERF類的轉(zhuǎn)錄因子，共包含180個(gè)氨基酸（如圖1所示）。
[0053] 實(shí)施例2 :青蒿AaGTDl基因的時(shí)空表達(dá)分析
[0054] 1.材料準(zhǔn)備
[0055] 根據(jù)實(shí)施例1中所使用的總RNA的提取方法，分別提取青蒿不同部位，包括：根， 莖，老葉，嫩葉，早期花苞，開花前花苞，盛花期花的總RNA，并反轉(zhuǎn)成cDNA，獲得空間表達(dá)分 析的材料；同時(shí)，按照上述方法，獲得生長至45-55cm高度青蒿的不同部位葉片的RNA和 cDNA，獲得不同發(fā)育階段葉片中AaGTDl基因表達(dá)分析的材料（如圖2所示）。
[0056] 2.實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析
[0057] 通過primer5設(shè)計(jì)AaGTDl基因和Actin內(nèi)參基因跨內(nèi)含子的定量PCR引物（表 1)，使用TAKARASYBR-GreenPCRMastermix試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析。儀器為 Thermal Cycler Dice，PCR采用兩步法，條件為：95°C，30s ;95°C，5s，60°C，30s，40個(gè)循環(huán)。 按照2_AAet值法計(jì)算基因相對表達(dá)量。
[0058] 表1定量PCR引物序列
[0059]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種青蒿AaGTDl基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
2. -種如權(quán)利要求1所述的青蒿AaGTDl基因編碼的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示。
3. -種如權(quán)利要求1所述的青蒿AaGTDl基因的表達(dá)盒、重組表達(dá)載體、重組菌或轉(zhuǎn)基 因植物。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的青蒿AaGTDl基因的表達(dá)盒、重組表達(dá)載體、重組菌或轉(zhuǎn)基因 植物，其特征在于，用于擴(kuò)增青蒿AaGTDl基因的引物對中，一條引物序列如SEQ ID N0:3所 示，另一條引物序列如SEQ ID NO:4所示。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的青蒿AaGTDl基因的表達(dá)盒、重組表達(dá)載體、重組菌或轉(zhuǎn)基因 植物，其特征在于，所述的重組表達(dá)載體為質(zhì)粒PHB-35SX2-AaGTDl。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的青蒿AaGTDl基因的表達(dá)盒、重組表達(dá)載體、重組菌或轉(zhuǎn)基因 植物，其特征在于，所述的重組菌為大腸桿菌、農(nóng)桿菌。
7. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的青蒿AaGTDl基因的表達(dá)盒、重組表達(dá)載體、重組菌或轉(zhuǎn)基因 植物，其特征在于，所述的轉(zhuǎn)基因植物為轉(zhuǎn)基因黃花蒿。
8. -種如權(quán)利要求1所述的青蒿AaGTDl基因在制備青蒿素中的應(yīng)用。
9. 一種如權(quán)利要求2所述的青蒿AaGTDl基因編碼的蛋白在制備青蒿素中的應(yīng)用。
10. -種如權(quán)利要求3所述的青蒿AaGTDl基因的表達(dá)盒、重組表達(dá)載體、重組菌或轉(zhuǎn)基 因植物在制備青蒿素中的應(yīng)用。
11. 一種如權(quán)利要求1所述的青蒿AaGTDl基因在提高植物組織中與促進(jìn)青蒿素合成相 關(guān)的酶的編碼基因的表達(dá)量中的應(yīng)用，其特征在于，所述的促進(jìn)青蒿素合成相關(guān)的酶的編 碼基因是 ADS、CYP71AV1，或 DBR2。
12. -種如權(quán)利要求2所述的青蒿AaGTDl基因編碼的蛋白作為轉(zhuǎn)錄因子的應(yīng)用。
13. -種提高黃花蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于，所述的方法包含以下步驟： A、 構(gòu)建青蒿AaGTDl基因的重組表達(dá)載體；所述的青蒿AaGTDl基因如SEQ ID NO: 1所 示； B、 將步驟A的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞農(nóng)桿菌，并將其轉(zhuǎn)化青蒿的愈傷組織； C、 通過抗生素篩選得到轉(zhuǎn)化成功的青蒿細(xì)胞，并培育使之長成完整植株。
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種青蒿中控制青蒿素合成和腺毛發(fā)育的AaGTD1基因及其編碼的蛋白與在制備青蒿素中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種青蒿AaGTD1基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；該基因編碼的蛋白AP2/ERF類轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。本發(fā)明中所述的應(yīng)用是指本發(fā)明中涉及的一種通過AaGTD1來提高青蒿中青蒿素含量的方法，包括如下步驟：將包含SEQ ID NO:1所示基因的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入青蒿細(xì)胞；培育轉(zhuǎn)化的青蒿細(xì)胞，得到青蒿素含量提高的青蒿植株。本發(fā)明的AaGTD1基因編碼的蛋白可以用來提高青蒿素的產(chǎn)量，為青蒿素的規(guī)模化生產(chǎn)提供高產(chǎn)、穩(wěn)定的植物材料有重要意義。
【IPC分類】C07K14-415, C12N15-29, C12N15-82, A01H5-00
【公開號】CN104651373
【申請?zhí)枴緾N201510054313
【發(fā)明人】張磊, 譚何新, 肖玲
【申請人】中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)
【公開日】2015年5月27日
【申請日】2015年2月3日