一種利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)定點突變P/TMS12-1獲得溫敏不育系的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及水稻溫敏不育系的培育方法，具體涉及一種利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)定 點突變P/TMS12-1獲得溫敏不育系的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 水稻（OryzasativaL.)是最主要的糧食作物之一，全世界超過一半的人口都以 水稻為主食。隨著人口的增長和可耕地面積的減少，糧食的供需變得越來越不平衡，增加 糧食單位面積產(chǎn)量已成為解決糧食供需不平衡的關(guān)鍵措施之一。幸運的是，雜交水稻可以 比常規(guī)優(yōu)質(zhì)水稻提高20-30%的產(chǎn)量，在解決糧食短缺的問題上起到了非常重要的作用，因 此，雜交水稻的種植面積逐年上升，現(xiàn)已超過水稻種植面積的60%。
[0003] 根據(jù)所使用的不育系類型的不同，雜交水稻育種的方法主要分為兩系法和三系 法。三系法通過使用細胞質(zhì)雄性不育系和恢復(fù)系產(chǎn)生雜種F1代種子，利用保持系和細胞 質(zhì)雄性不育系雜交保留細胞質(zhì)雄性不育系；但是只有少數(shù)水稻品種可以作為恢復(fù)系，這大 大降低了恢復(fù)系與不育系間的遺傳多樣性，限制了雜種優(yōu)勢的利用。而兩系法主要利用光 /溫敏雄性核不育系來實現(xiàn)，因為光/溫敏不育系育性受日長和溫度調(diào)控，在不育條件下可 作為不育系，在可育條件下可作為保持系，一系兩用。而且由于不受核質(zhì)互作影響，幾乎所 有的正常品種都可以作為恢復(fù)系?；谶@個本質(zhì)上的差異，兩系法雜交技術(shù)具有更為廣泛 的恢復(fù)系，不需要特殊的恢復(fù)基因，使得配組更加自由，利于亞種間雜種優(yōu)勢的利用，對提 高雜交稻組合的產(chǎn)量、米質(zhì)、抗性等存在更大的潛在優(yōu)勢；不育系可一系兩用，不需要保持 系，簡化了生產(chǎn)程序；溫敏不育受核基因控制，與細胞質(zhì)無關(guān)，豐富了細胞質(zhì)遺傳物質(zhì)的多 樣性，可以避免三系雜交稻不育細胞質(zhì)的負效應(yīng)和細胞質(zhì)單一可能帶來的潛在危險。因此， 溫敏不育系在雜交水稻育種中潛力巨大，相比而言，目前廣泛應(yīng)用的為溫敏不育系。
[0004] 溫敏不育材料往往通過自然突變獲得，自然突變頻率非常低，而用傳統(tǒng)育種手段 將自然突變的溫敏不育材料培育成為溫敏不育系過程漫長，如何提高溫敏不育系的培育效 率已成為迫切需要解決的問題。要突破傳統(tǒng)育種的局限，必須使用基因工程手段。盡管， RNAi和反義RNA技術(shù)可以實現(xiàn)對基因的抑制表達，但是并不能徹底刪除基因的功能，基因 殘留的功能會提高轉(zhuǎn)基因植株的不育起點溫度，不利于育種的安全，而且轉(zhuǎn)基因植株中會 殘留外源序列，涉及轉(zhuǎn)基因安全問題。近年來，定點突變技術(shù)取得了突破性進展，已廣泛應(yīng) 用于各種生物中。這些方法都是通過靶識別序列或引導(dǎo)序列將核酸酶引導(dǎo)到靶標位置，然 后核酸酶切割靶標DNA，在細胞自身修復(fù)系統(tǒng)的作用下將切斷的DNA修復(fù)鏈接起來，但是在 修復(fù)過程中往往會導(dǎo)致堿基丟失，因此該上述方法可以獲得定點突變效果。目前，已經(jīng)通過 RNAi技術(shù)干涉光/溫敏不育基因，獲得溫敏不育植株；但是RNAi技術(shù)只是降低了光/溫敏 不育基因的表達量，并不能徹底的使其失活，使轉(zhuǎn)基因植株有較高的不育起點溫度，且不育 起點溫度不穩(wěn)定，影響制種安全。另外，利用定點突變技術(shù)可以1-2年內(nèi)獲得溫敏不育系， 而利用傳統(tǒng)育種技術(shù)，無論是培育三系不育系還是兩系不育系都需要數(shù)年甚至10年以上 時間。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種利用CRISPR/Cas9系統(tǒng) 定點突變P/TMS12-1獲得溫敏不育系的方法，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)，徹底的失活了P/ TMS12-1非編碼RNA的活性，人工培育出不帶轉(zhuǎn)基因成分的溫敏不育系，具有目的性強，基 因組損傷小等優(yōu)點，可規(guī)避轉(zhuǎn)基因帶來的可能風(fēng)險。
[0006] 為解決上述問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下：
[0007] -種利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)定點突變PTMS12-1獲得溫敏不育系的方法，其包括以 下步驟：
[0008] 1)克隆控制培矮64S溫敏不育的主效基因P/TMS12-1片段；
[0009]2)根據(jù)CRISPR/Cas9系統(tǒng)靶標設(shè)計原則在上述P/TMS12-1片段序列中設(shè)計靶標序 列；
[0010] 3)構(gòu)建含靶標序列序列的pU3-gRNA載體；
[0011] 4)利用上述pU3-gRNA載體構(gòu)建含靶標序列序列的pCRISPR/Cas9載體；
[0012] 5)利用上述含靶標序列序列的pCRISPR/Cas9載體獲得陽性轉(zhuǎn)基因苗；
[0013] 6)利用上述陽性轉(zhuǎn)基因苗獲得突變植株；
[0014] 7)將上述突變植株傳代種植后獲得不帶轉(zhuǎn)基因成分且育性恢復(fù)可育的植株作為 溫敏不育株。
[0015] 本發(fā)明步驟2)中所述P/TMS12-1雙鏈片段中的一條鏈具有以下結(jié)構(gòu)： 5' -Nx-NGG-3'，也可以是 5' -Nx-NAG-3' 或 5' -Nx-NGA-3'，N表示A，T，C和G中的任意一個， 14SXS30。較好的靶位點序列以A或G開頭。本發(fā)明根據(jù)靶標的設(shè)計原則步驟2)中在 P/TMS12-1 的前體RNA區(qū)找到 25 個 5'-Nx-NGG-3'，60 個 5'-Nx-NAG-3'，48 個 5'-Nx-NGA-3' 序列作為靶標。
[0016] 上述方案中，步驟3)的具體步驟為：首先合成帶粘性末端的祀標序列，將接頭序 列變性后移至室溫冷卻完成退火；將退火后的序列鏈接到經(jīng)酶切后的pU3_gRNA載體上，經(jīng) PCR擴增和測序驗證陽性質(zhì)粒。
[0017] 上述方案中，步驟4)的具體步驟為：將含靶標序列的gRNA表達盒從pU3-gRNA載 體上切下后鏈接到含Cas9表達盒的pCRISPR/Cas9載體上。
[0018] 上述方案中，步驟5)的具體步驟為：將含靶標的pCRISPR/Cas9載體轉(zhuǎn)化水稻愈傷 組織，經(jīng)篩選，分化和生根成苗，煉苗后種植于網(wǎng)室；通過潮霉素鑒定獲得陽性轉(zhuǎn)基因植株。 本發(fā)明中將含靶標的pCRISPR/Cas9載體轉(zhuǎn)化水稻愈傷組織的方法是通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺 傳轉(zhuǎn)化法或基因槍法。也可以是能實現(xiàn)其轉(zhuǎn)化的其他生物學(xué)方法。
[0019] 上述方案中，步驟6)的具體步驟為：提取上述陽性轉(zhuǎn)基因植株的DNA，用引物SEQ IDNO. 9和SEQIDNO. 10擴增上述DNA，產(chǎn)物經(jīng)純化后送公司測序，測序結(jié)果與未轉(zhuǎn)基因的 野生型植株序列比較，分析突變情況，獲得I；代突變植株。
[0020] 上述方案中，獲得不帶轉(zhuǎn)基因成分的溫敏不育突變體的步驟具體為：收獲I代已 實現(xiàn)定點突變的植株的種子，在高溫/長日條件下種植1\代植株，通過育性觀察和潮霉素 鑒定分離到不帶轉(zhuǎn)基因成分且表型不育的植株種植于低溫/短日條件下，育性可恢復(fù)的植 株作為溫敏不育株，經(jīng)自交或回交等方法繁殖后獲得溫敏不育系。
[0021] 相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果在于：
[0022] 1.本發(fā)明所述的利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)定點突變P/TMS12-1獲得溫敏不育系的方 法，利用上述技術(shù)定點突變已經(jīng)克隆的溫敏不育基因，實現(xiàn)了人工培育實用型溫敏不育系， 并且這種溫敏不育系是不帶轉(zhuǎn)基因成分的，與利用化學(xué)、物理誘變獲得的突變體沒有本質(zhì) 的區(qū)別，只是目的性強，基因組損傷小，規(guī)避轉(zhuǎn)基因帶來的可能風(fēng)險等優(yōu)點；
[0023] 2.本發(fā)明所述的利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)定點突變P/TMS12-1獲得溫敏不育系的 方法加快了育種的進程，節(jié)省了時間、成本；
[0024] 3.傳統(tǒng)育種無論回交、自交多少代都會或多或少的改變遺傳背景并導(dǎo)致一些優(yōu)良 性狀丟失；本發(fā)明所述的利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)定點突變P/TMS12-1獲得溫敏不育系的方 法不改變受體材料的遺傳背景，并可以通過將三系雜交水稻的保持系定點突變?yōu)闇孛舨挥?系，達到三系改為兩系雜交稻，拓寬恢復(fù)系的選擇范圍，提高雜種優(yōu)勢利用效率，進而提高 產(chǎn)量、抗性和稻米品質(zhì)；
[0025] 4.本發(fā)明通過測序35個主流實用型溫敏不育系，發(fā)現(xiàn)33個溫敏不育系的tms5序 列與安農(nóng)S-1完全一致，而另外2個溫敏不育系的p/tmsl2-l序列與培矮64S完全一致；說 明通過自然突變或傳統(tǒng)的人工誘變已知溫敏不育基因失活是非常困難的；誘變新的可用于 兩系雜交育種的溫敏不育系也是非常困難的。因此，本方法改變了這一現(xiàn)狀。
[0026] 下面結(jié)合附圖和【具體實施方式】對本發(fā)明作進一步詳細說明。
【附圖說明】
[0027] 圖1為p/tmsl2_l的分子定位和功能互補策略圖；A，p/tmsl2_l被精細定位到第 12染色體的5. 8kb區(qū)間內(nèi)；B，定位區(qū)間內(nèi)的基因預(yù)測，并且顯示了唯一的點突變；C，用于功 能互補片段的示意圖；
[0028] 圖2為PA10. 4、PA9、PA2. 4以及PA0. 3功能互補植株的花粉育性；A，低溫下的培矮 64S的花粉育性；B，高溫下的培矮64S的花粉育性；C，高溫下的PA10. 4的花粉育性；D，高溫 下的PA9的花粉育性；E，高溫下的PA2. 4的花粉育性；F，高溫下的PA0. 37的花粉育性；
[0029] 圖3為本發(fā)明實施例2所獲得的P/TMS12-1-1的代植株潮霉素陽性檢測結(jié)果 圖，其中1-10分別為P/TMS12-1-1的1\代植株中的10株，+表示陽性對照，-表示陰性對 昭.
[0030] 圖4為實施例2中P/TMS12-1-1-3是P/TMS12-1-1的代植株中第3株在不同 溫度條件下生長時的花粉育性結(jié)果圖，其中，HT表示高溫，LT表示低溫，WT表示轉(zhuǎn)基因前的 植株，bar表示100ym;
[0031] 圖5為實施例3中所獲得的P/TMS12-1-2的1\代植株潮霉素陽性檢測結(jié)果圖，其 中1-