10分別為P/TMS12-1-2的代植株中的10株，+表示陽(yáng)性對(duì)照，-表示陰性對(duì)照；
[0032] 圖6為本發(fā)明實(shí)施例3獲得的P/TMS12-1-2-7是P/TMS12-1-2的代植株中第7 株在不同溫度條件下的花粉育性，其中ZH11表示野生型水稻中花11，HT表示高溫，LT表示 低溫，bar表示100ym〇
【具體實(shí)施方式】
[0033] -種利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)定點(diǎn)突變PTMS12-1獲得溫敏不育系的方法，其包括以 下步驟：
[0034] 1)克隆控制培矮64S溫敏不育的主效基因P/TMS12-1片段；
[0035] 2)根據(jù)CRISPR/Cas9系統(tǒng)靶標(biāo)序列設(shè)計(jì)原則在上述P/TMS12-1片段序列中設(shè)計(jì)靶 標(biāo)引物；
[0036] 3)構(gòu)建含靶標(biāo)序列片段的pU3_gRNA載體；
[0037] 4)利用上述pU3_gRNA載體構(gòu)建含靶標(biāo)序列片段的pCRISPR/Cas9載體；
[0038] 5)利用上述含靶標(biāo)序列片段的pCRISPR/Cas9載體獲得陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因苗；
[0039] 6)利用上述陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因苗獲得突變植株；
[0040] 7)將上述突變植株傳代種植后獲得不帶轉(zhuǎn)基因成分但育性恢復(fù)可育的植株作為 溫敏不育株。
[0041] 本發(fā)明所述P/TMS12-1雙鏈片段中的一條鏈具有以下結(jié)構(gòu)：5'-Nx-NGG-3'，也可以 是5' -Nx-NAG-3'或5' -Nx-NGA-3'，N表示A，T，C和G中的任意一個(gè)，14彡X彡30。較佳 的靶位點(diǎn)序列以A或G開(kāi)頭。本發(fā)明根據(jù)靶標(biāo)的設(shè)計(jì)原則在P/TMS12-1的前體RNA區(qū)找到 25個(gè)5' -Nx-NGG-3'，60個(gè)5' -Nx-NAG-3'，48個(gè)5' -Nx-NGA-3'序列作為靶標(biāo)。
[0042] 上述方案中，構(gòu)建含祀標(biāo)序列的pU3_gRNA載體具體步驟為：首先合成帶粘性末端 的靶標(biāo)序列，將接頭序列變性后移至室溫冷卻完成退火；將退火后的序列鏈接到經(jīng)酶切后 的pU3-gRNA載體上，經(jīng)PCR擴(kuò)增和測(cè)序驗(yàn)證陽(yáng)性質(zhì)粒。
[0043] 上述方案中，構(gòu)建含靶標(biāo)序列片段的pCRISPR/Cas9載體是將含靶標(biāo)序列片段的 gRNA表達(dá)盒從pU3-gRNA上切下，然后鏈接到含Cas9表達(dá)盒的pCRISPR/Cas9載體上。
[0044] 上述方案中，獲得轉(zhuǎn)基因苗的步驟是將含靶標(biāo)的pCRISPR/Cas9載體轉(zhuǎn)化水稻愈 傷組織，經(jīng)篩選，分化和生根成苗，將轉(zhuǎn)基因植株種植于網(wǎng)室；通過(guò)潮霉素鑒定陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因 植株。本發(fā)明中將含靶標(biāo)的pCRISPR/Cas9載體轉(zhuǎn)化水稻愈傷組織的方法是通過(guò)農(nóng)桿菌介 導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化或基因槍法。也可以是能實(shí)現(xiàn)其轉(zhuǎn)化的其他生物學(xué)方法。
[0045] 上述方案中，突變位點(diǎn)的鑒定步驟具體為：提取陽(yáng)性植株的DNA，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增上 述DNA，經(jīng)純化后，測(cè)序，分析突變情況。
[0046] 上述方案中，獲得不帶轉(zhuǎn)基因成分的溫敏不育系的步驟具體為：收獲I代實(shí)現(xiàn)定 點(diǎn)突變的植株的種子，在長(zhǎng)日/高溫條件下種植代植株，通過(guò)表型觀(guān)察和潮霉素陽(yáng)性檢 測(cè)分離到不帶轉(zhuǎn)基因成分但表型不育的植株種植于短日/低溫條件下，育性恢復(fù)可育的植 株作為溫敏不育株，經(jīng)自交或回交等方法繁殖后獲得溫敏不育系。
[0047] 實(shí)施例1
[0048] 克隆獲得的克隆控制培矮64S溫敏不育的主效基因P/TMS12-1雙鏈片段，步驟如 下：
[0049] 1)溫敏不育基因p/tmsl2-l的定位
[0050] 在培矮64S第12染色體上存在一個(gè)主效基因p/tmsl2-l定位在在第12染色體 BAC克隆AL731757上分子標(biāo)記PA301和PAIDL2之間5. 8kb的物理區(qū)間內(nèi)，參見(jiàn)圖1;
[0051] 2)克隆P/TMS12-1雙鏈片段
[0052]對(duì)該區(qū)間序列分析發(fā)現(xiàn)培矮64S中存在一個(gè)C-G突變的SNP，該區(qū)間進(jìn)行基因 預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)有兩個(gè)可能的基因，上述SNP位于這兩個(gè)候選基因之間；將這兩個(gè)預(yù)測(cè)基因作為 候選基因，克隆兩個(gè)分別包含上述預(yù)測(cè)基因且片段較大的DNA用于功能互補(bǔ)，分別命名為PA10. 4(SEQIDNO. 1)和PA9(SEQIDNO. 2);這兩個(gè)片段之間有一段2. 4kb的重疊區(qū)，C-G 的SNP也存在于這個(gè)重疊區(qū)；將這兩個(gè)片段轉(zhuǎn)化培矮64S后恢復(fù)了它們長(zhǎng)日/高溫下的花 粉育性；確定控制溫敏不育的基因應(yīng)該位于PA10. 4和PA9之間重疊的2. 4kb區(qū)間內(nèi)，克隆 該區(qū)間片段用于功能互補(bǔ)，并將其命名為PA2. 4,（SEQIDNO. 3);
[0053] 經(jīng)過(guò)對(duì)花粉母細(xì)胞到減數(shù)分裂時(shí)期的培矮64和培矮64S的幼穗為材料進(jìn) 行了全基因組的測(cè)序；分析測(cè)序結(jié)果顯示，上述2. 4kb區(qū)間內(nèi)存在一個(gè)smallRNA: CAUUGUUUGUCGUACCAUCCAU(SEQIDNO. 4);將包含上述smallRNA的一段片段作為前體克隆 到ubiquitin啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的過(guò)量表達(dá)載體上，將其命名為PAO. 37(SEQIDNO. 5)，并轉(zhuǎn)化培 矮64S，結(jié)果也恢復(fù)了其長(zhǎng)日/高溫下的花粉育性，從而，確定SEQIDNO. 4片段為控制培矮 64S溫敏雄性不育的片段。
[0054]PA10. 4和PA9以及PA2. 4、PA0. 37功能互補(bǔ)轉(zhuǎn)化培矮64S后，花粉育性結(jié)果參見(jiàn) 圖2;圖2的結(jié)果顯示PA10. 4、PA9以及PA2. 4、PA0. 37復(fù)了培矮64S高溫長(zhǎng)日下的花粉育 性。
[0055] 實(shí)施例2
[0056] 在粳稻品種中花11中利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)定點(diǎn)突變P/TMS12-1獲得溫敏不育 系，具體步驟如下：
[0057] 1)利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)根據(jù)實(shí)施例1的SEQID NO. 4片段序列設(shè)計(jì)靶標(biāo)序列：
[0058] Target-P/TMS12-1-1(SEQ ID NO. 6) ：CTAGATGCAGTATAACTTCT；
[0059] 2)構(gòu)建含Target-P/TMS12-1-1片段的pU3-gRNA載體：
[0060] 首先合成帶粘性末端的靶標(biāo)引物P/TMS12-1-1F(SEQIDNO. 7): GGCACTAGATGCAGTATAACTTCT，P/TMS12-1-1(SEQIDN0.8) :AAACAGAAGTTATACTGCATCTAG;將 接頭引物變性后移至室溫冷卻完成退火，將退火后的引物鏈接到經(jīng)酶切后的pU3-gRNA載 體上；經(jīng)PCR擴(kuò)增和測(cè)序驗(yàn)證獲得含Target-P/TMS12-1-1片段的陽(yáng)性質(zhì)粒；
[0061] 3)含Target-P/TMS12-1-1片段的pCRISPR/Cas9載體構(gòu)建：
[0062] 將含Target-P/TMS12-1-1片段的陽(yáng)性質(zhì)粒中的gRNA表達(dá)盒從pU3-gRNA上切下， 然后鏈接到含Cas9表達(dá)盒的pCRISPR/Cas9載體上；
[0063] 4)利用上述含靶標(biāo)序列片段的pCRISPR/Cas9載體獲得陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因苗：
[0064] 將含靶標(biāo)的pCRISPR/Cas9載體通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化水稻愈傷組織； 經(jīng)篩選，分化和生根成苗，將轉(zhuǎn)基因植株種植于網(wǎng)室，通過(guò)潮霉素鑒定陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株；
[0065] 5)利用上述陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因苗獲得突變植株：
[0066] 提取上述陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株的DNA，用引物P/TMS12-1-3F(SEQIDNO. 9): GCAGAGACATAGATGAGCAAC和P/TMS12-1-3R(SEQIDN0.10):GAAGTCTTGGITGCACATCC擴(kuò)增上 述DNA，產(chǎn)物經(jīng)純化后送公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與轉(zhuǎn)基因前的野生型植株序列比較，分析突變 情況；具體參見(jiàn)SEQIDNO. 11-SEQIDNO. 16;
[0067] WT(SEQ ID NO. 11) ：CAACACGCAGTTCAGATACTCTAGATGCAGTATAACTTCTCGGGTCTATCTA TAACGGAG
[0068] P/TMS12-1-1-11(SEQ ID NO. 12) ：CAACACGCAGTTCAGATACTCTAG ATGCAGTATAACTTT CTCGGGTCTATCTATAACGGAG
[0069] P/TMS12-1-1-12(SEQIDNO. 13) :CAACACGCAGTTCAGATACTCTAGATGCAGTATAA**TCT CGGGTCTATCTATAACGGAG
[0070] P/TMS12-1-1-13(SEQIDNO. 14) :CAACACGCAGTTCAGATACTCTAGATGCAGTATAA***CT CGGGTCTATCTATAACGGAG
[0071]P/TMS12-1-1-14(SEQIDNO. 15) :CAACACGCAGTTCAGATACTCTAGATGCAG********** *#GTCTATCTATAACGGAG
[0072]P/TMS12-1-1-15(SEQIDNO. 16) :CAACACGCAGTTCAGATACTCTAGATGCAGTATA****** CGGGTCTATCTATAACGGAG
[0073] 其中，P/TMS12-1-1-11，-12，-13，-14和-15表示不同的轉(zhuǎn)基因株系；WT表示野生 型；序列中"X"表不插入的喊基，表不喊基缺失；測(cè)序結(jié)果顯不：突變植株占總陽(yáng)性轉(zhuǎn)基 因植株的58%，突變類(lèi)型為堿基插入或刪除，突變位置始于NGG上游第3到4個(gè)堿基之間； 即堿基的缺失和插入說(shuō)明定點(diǎn)突變成功；
[0074] 6)將上述