高變區(qū)，包含三個CDR和更多保守區(qū)（所謂的構(gòu)架區(qū)（FR))。高變區(qū)包含來自CDR的氨基 酸殘基和來自高變環(huán)的氨基酸殘基。旨在落在本發(fā)明的范圍內(nèi)的功能變異體與如在此所定 義的親本結(jié)合分子具有至少約80%到約99%、優(yōu)選地至少約70%到約99%、更優(yōu)選地至少 約80 %到約99 %、甚至更優(yōu)選地至少約90 %到約99 %、最優(yōu)選地至少約95 %到約99 %、特 別是至少約97%到約99%氨基酸序列一致性和/或同源性。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已知 的計算機(jī)算法（尤其諸如Gap或Bestfit)可以用以最佳地比對待比較的氨基酸序列并且 定義類似或相同氨基酸殘基。功能變異體可以通過以本領(lǐng)域中已知的一般分子生物學(xué)方法 (包括但不限于易錯PCR、寡核苷酸定向誘變、定點誘變以及重和/或輕鏈改組）改變親本 結(jié)合分子或其部分而獲得。
[0084] 在某些實施例中，本發(fā)明的功能變異體針對B型肝炎病毒具有中和活性。與親本 結(jié)合分子相比，中和活性可以或者相同，或者更高或更低。如本申請中所用，當(dāng)使用術(shù)語 (人類）結(jié)合分子時，此術(shù)語還涵蓋（人類）結(jié)合分子的功能變異體。在某些實施例中，功能 變異體是包含以下的結(jié)合分子：一個重鏈可變序列，與SEQ ID N0:7相比包含一個或多個氨 基酸突變，諸如一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個、十一個、十二個、 十三個、十四個或十五個氨基酸突變；和/或一個輕鏈可變區(qū)，與SEQ ID N0:8相比包含一 個或多個氨基酸突變，諸如一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個、十一 個、十二個、十三個、十四個或十五個氨基酸突變。
[0085] 在某些實施例中，根據(jù)本發(fā)明的結(jié)合分子用作一種藥劑，并且優(yōu)選地用于對由來 自不同血清型和基因型的B型肝炎病毒引起的一種B型肝炎感染進(jìn)行治療性和/或預(yù)防性 治療。
[0086] 本發(fā)明還涉及藥物組合物，包含至少一種根據(jù)本發(fā)明的結(jié)合分子和至少一種藥學(xué) 上可接受的賦形劑。
[0087] 在又另一個實施例中，本發(fā)明涉及一種根據(jù)本發(fā)明的結(jié)合分子的用途，用于制備 用于對一種B型肝炎病毒感染進(jìn)行預(yù)防和/或治療的一種藥劑。具體來說，根據(jù)本發(fā)明的 結(jié)合分子用于預(yù)防一個新鮮移植的肝的B型肝炎病毒再感染。
[0088] 在又另一個方面，本發(fā)明提供了免疫偶聯(lián)物（即分子），包含至少一種如在此所定 義的結(jié)合分子并且進(jìn)一步包含至少一種標(biāo)簽（尤其諸如一種可檢測部分/藥劑）。本發(fā)明 中還涵蓋根據(jù)本發(fā)明的免疫偶聯(lián)物的混合物或至少一種根據(jù)本發(fā)明的免疫偶聯(lián)物與另一 種分子（諸如一種治療劑或另一種結(jié)合分子或免疫偶聯(lián)物）的混合物。在其他實施例中， 本發(fā)明的免疫偶聯(lián)物可以包含多于一種標(biāo)簽。這些標(biāo)簽可以與彼此相同或不同并且可以非 共價連接/偶聯(lián)到結(jié)合分子。這個或這些標(biāo)簽也可以通過共價鍵結(jié)而直接連接/偶聯(lián)到人 類結(jié)合分子?？商娲?，這個或這些標(biāo)簽可以借助于一種或多種鍵聯(lián)化合物而連接/偶聯(lián) 到結(jié)合分子。用于使標(biāo)簽偶聯(lián)到結(jié)合分子的技術(shù)為熟練的業(yè)內(nèi)人士所熟知。
[0089] 本發(fā)明的免疫偶聯(lián)物的標(biāo)簽可以是治療劑，但它們還可能是可檢測部分/藥劑。 適合于治療和/或預(yù)防中的標(biāo)簽可以是毒素或其功能部分、抗生素、酶、增強(qiáng)吞噬作用或免 疫刺激的其他結(jié)合分子。包含一種可檢測藥劑的免疫偶聯(lián)物可以用以例如診斷上評估一個 受試者是否已經(jīng)感染一種B型肝炎病毒，或監(jiān)測一種B型肝炎病毒感染的發(fā)展或進(jìn)展作為 一種臨床測試程序的一部分以例如測定一種既定治療方案的功效。然而，它們還可以用于 其他檢測和/或分析和/或診斷目的?？蓹z測部分/藥劑包括但不限于酶、輔基、熒光物質(zhì)、 發(fā)光物質(zhì)、生物發(fā)光物質(zhì)、放射性物質(zhì)、發(fā)射正電子的金屬以及非放射性順磁性金屬離子。 出于檢測和/或分析和/或診斷目的用以標(biāo)記結(jié)合分子的標(biāo)簽取決于所用的特定檢測/分 析/診斷技術(shù)和/或方法，尤其諸如（組織）樣品的免疫組織化學(xué)染色、流式細(xì)胞檢測、掃 描激光流式細(xì)胞檢測、熒光免疫分析、酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA)、放射免疫分析（RIA)、生 物分析（例如吞噬作用分析）、蛋白質(zhì)印跡應(yīng)用等。適用于本領(lǐng)域中已知的檢測/分析/診 斷技術(shù)和/或方法的標(biāo)記完全屬于熟練的業(yè)內(nèi)人士的能力內(nèi)。
[0090] 此外，本發(fā)明的人類結(jié)合分子或免疫偶聯(lián)物還可以連接到尤其可用于體外免疫分 析或純化B型肝炎病毒或其片段的固體支撐體。此類固體支撐體可以是多孔或無孔的，平 面或非平面的。本發(fā)明的結(jié)合分子可以融合到標(biāo)記序列（諸如一種肽）以促進(jìn)純化?？商?代地，一種抗體可以偶聯(lián)到一種第二抗體以形成一種抗體異源偶聯(lián)物。在另一個方面，本 發(fā)明的結(jié)合分子可以偶聯(lián)/連接到一種或多種抗原。優(yōu)選地，這些抗原是由被給予結(jié)合分 子-抗原偶聯(lián)物的一個受試者的免疫系統(tǒng)識別的抗原。這些抗原可以是相同的，但也可以 與彼此不同。用于連接抗原與結(jié)合分子的偶聯(lián)方法在本領(lǐng)域中是熟知的并且包括但不限于 使用交聯(lián)劑。本發(fā)明的結(jié)合分子將結(jié)合到B型肝炎病毒，并且連接到結(jié)合分子的抗原將引 發(fā)對偶聯(lián)物的有力的T細(xì)胞攻擊，這將最終導(dǎo)致破壞B型肝炎病毒。
[0091] 次于通過直接或經(jīng)由例如一個連接子間接偶聯(lián)以化學(xué)方式產(chǎn)生免疫偶聯(lián)物，免疫 偶聯(lián)物可以產(chǎn)生為包含本發(fā)明的結(jié)合分子與一種適合標(biāo)簽的融合蛋白。融合蛋白可以通過 本領(lǐng)域中已知的方法而產(chǎn)生，這些方法諸如例如通過構(gòu)建在框架中包含編碼這些結(jié)合分子 的核苷酸序列與編碼這個或這些適合標(biāo)簽的核苷酸序列的核酸分子并且然后表達(dá)這些核 酸分子來重組地進(jìn)行。
[0092] 本發(fā)明的另一個方面是提供編碼至少一種根據(jù)本發(fā)明的結(jié)合分子、功能變異體或 免疫偶聯(lián)物的核酸分子。此類核酸分子可以用作中間物用于克隆目的，例如用于如上文所 描述的親和力成熟過程中。在一個優(yōu)選實施例中，這些核酸分子被分離或純化。
[0093] 技術(shù)人士應(yīng)理解，這些核酸分子的功能變異體也旨在是本發(fā)明的一部分。功能變 異體是可以使用標(biāo)準(zhǔn)遺傳密碼來直接翻譯以提供與翻譯自親本核酸分子的氨基酸序列相 同的一種氨基酸序列的核酸序列。
[0094] 優(yōu)選地，這些核酸分子編碼包含如上文所描述的⑶R區(qū)的結(jié)合分子。在另一個實 施例中，這些核酸分子編碼包含本發(fā)明的結(jié)合分子的兩個、三個、四個、五個或甚至全部六 個⑶R區(qū)的結(jié)合分子。
[0095] 在另一個實施例中，這些核酸分子編碼包括一條重鏈的結(jié)合分子，該重鏈包含如 上文所描述的可變重鏈序列。在另一個實施例中，這些核酸分子編碼包括一條輕鏈的結(jié)合 分子，該輕鏈包含如上文所描述的可變輕鏈序列。以下給出本發(fā)明的結(jié)合分子的重和輕鏈 可變區(qū)的核苷酸序列和氨基酸序列。
[0096] 本發(fā)明的另一個方面是提供包含一種或多種根據(jù)本發(fā)明的核酸分子的載體（即 核酸構(gòu)建體）。載體可以來源于質(zhì)粒，尤其諸如F、Rl、RP1、Col、pBR322T0L、Ti等；粘粒； 噬菌體，諸如X、人字形、M13、Mu、Pl、P22、QP、T-偶數(shù)、T-奇數(shù)、T2、T4、I7等；植物病毒。 載體可以用于克隆和/或用于表達(dá)本發(fā)明的結(jié)合分子并且甚至可以用于基因治療目的?？?操作地連接到一種或多種調(diào)節(jié)表達(dá)的核酸分子、包含一種或多種根據(jù)本發(fā)明的核酸分子的 載體也由本發(fā)明涵蓋。載體的選擇取決于所遵循的重組程序和所用的宿主。在宿主細(xì)胞中 引入載體可以尤其通過磷酸鈣轉(zhuǎn)染、病毒感染、DEAE-右旋糖酐介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、脂染胺轉(zhuǎn)染或 電穿孔來實現(xiàn)。載體可以自主地復(fù)制或可以與它們已經(jīng)被整合進(jìn)入的染色體一起復(fù)制。優(yōu) 選地，這些載體含有一種或多種選擇標(biāo)記。這些標(biāo)記的選擇可能取決于所選宿主細(xì)胞，但如 本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所熟知，這對本發(fā)明不是關(guān)鍵的。它們包括但不限于卡那霉素、新霉 素、嘌呤霉素、潮霉素、博萊霉素、來自單純皰疹病毒的胸苷激酶基因（HSV-TK)、來自小鼠的 二氫葉酸還原酶基因（dhfr)?？刹僮鞯剡B接到編碼可以用以分離人類結(jié)合分子的蛋白質(zhì)或 肽的一種或多種核酸分子、包含編碼如上文所描述的人類結(jié)合分子的一種或多種核酸分子 的載體也由本發(fā)明涵蓋。這些蛋白質(zhì)或肽包括但不限于谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、麥芽糖結(jié)合 蛋白、金屬結(jié)合聚組胺酸、綠色熒光蛋白、熒光素酶以及半乳糖苷酶。
[0097] 含有上文所提及的載體的一種或多種復(fù)本的宿主是本發(fā)明的另一個方面。優(yōu)選 地，宿主是宿主細(xì)胞。宿主細(xì)胞包括但不限于哺乳動物、植物、昆蟲、真菌或細(xì)菌來源的細(xì) 胞。細(xì)菌細(xì)胞包括但不限于來自革蘭氏陽性細(xì)菌或革蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)胞，這些細(xì)菌諸 如埃希氏桿菌屬（Escherichia)(諸如大腸桿菌（E.coli))和假單胞菌屬（Pseudomonas) 的若干物種。在真菌細(xì)胞的群組中，優(yōu)選地使用酵母細(xì)胞。酵母中的表達(dá)可以通過使用 酵母菌株（尤其諸如巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris)、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)以及多形漢遜酵母（Hansenula polymorpha))來實現(xiàn)。此外，昆蟲細(xì)胞（諸 如來自果蠅的細(xì)胞和Sf9)可以用作宿主細(xì)胞。除此之外，宿主細(xì)胞可以是植物細(xì)胞，尤其 諸如來自作物植物（諸如林業(yè)植物）的細(xì)胞，或來自供應(yīng)食物和原料的植物（諸如谷類植 物或藥用植物）的細(xì)胞，或來自觀賞植物的細(xì)胞，或來自花苞作物的細(xì)胞。轉(zhuǎn)化的（轉(zhuǎn)基 因）植物或植物細(xì)胞通過已知方法來產(chǎn)生，這些方法例如土壤桿菌屬介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移、葉 盤片的轉(zhuǎn)化、通過聚乙二醇誘發(fā)的DNA轉(zhuǎn)移進(jìn)行的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、電穿孔、聲處理、顯微注 射或彈道基因轉(zhuǎn)移。另外，一種適合表達(dá)系統(tǒng)可以是一種桿狀病毒系統(tǒng)。使用哺乳動物細(xì) 胞（諸如中國倉鼠卵巢（CH0)細(xì)胞、C0S細(xì)胞、BHK細(xì)胞、NS0細(xì)胞或Bowes黑色素瘤細(xì)胞） 的表達(dá)系統(tǒng)在本發(fā)明中是優(yōu)選的。哺乳動物細(xì)胞為表達(dá)的蛋白提供了最類似于哺乳動物來 源的天然分子的翻譯后修飾。因為本發(fā)明處理可能必須被給予人類的分子，所以一種完全 人類表達(dá)系統(tǒng)將尤其優(yōu)選。因此，甚至更優(yōu)選地，宿主細(xì)胞是人類細(xì)胞。人類細(xì)胞的實例尤 其是海拉、9114!'10804549、293以及冊1(2931'細(xì)胞。在優(yōu)選實施例中，人類生產(chǎn)細(xì)胞至少 包含編碼一種腺病毒E1區(qū)的一種核酸序列（呈可表達(dá)形式）的一個功能部分。在甚至更 優(yōu)選實施例中，所述宿主細(xì)胞來源于一個人類視網(wǎng)膜并且用包含腺病毒E1序列的核酸永 生化，諸如911細(xì)胞或1996年2月29日以編號96022940寄存在歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心 (European Collection of Cell Cultures，ECACC)，應(yīng)用微生物研究中心（CAMR)，索爾茲伯 里（Salisbury)，威爾特郡 SP40JG (Wiltshire SP40JG)，大不列顛（Great Britain)并且以 商標(biāo)PER.C6? (PER. C6是克魯賽爾荷蘭公司（Crucell Holland B.V.)的一個注冊商標(biāo)） 市售的細(xì)胞系。出于本申請的目的，"PER. C6細(xì)胞"是指以編號96022940寄存的細(xì)胞或所 寄存細(xì)胞的祖細(xì)胞、上游或下游傳代細(xì)胞以及來自祖細(xì)胞的后代細(xì)胞以及前述中任一者的 衍生物。在宿主細(xì)胞中產(chǎn)生重組蛋白可以根據(jù)本領(lǐng)域中熟知的方法來進(jìn)行。使用以商標(biāo) PER.C6I(市售的細(xì)胞作為用于所關(guān)注的蛋白質(zhì)的一個生產(chǎn)平臺已經(jīng)描述于W0 00/63403 中，該文獻(xiàn)的披露內(nèi)容通過引用以其全文結(jié)合在此。
[0098] -種產(chǎn)生一種根據(jù)本發(fā)明的結(jié)合分子的方法是本發(fā)明的另一個方面。該方法包 括以下步驟：a)在有助于該結(jié)合分子的表達(dá)的條件下培養(yǎng)一種根據(jù)本發(fā)明的宿主，和b)任 選地回收表達(dá)的結(jié)合分子。表達(dá)的結(jié)合分子可以從無細(xì)胞提取物回收，但優(yōu)選地它們從培 養(yǎng)基回收。以上產(chǎn)生方法還可以用以制造本發(fā)明的結(jié)合分子的功能變異體和/或免疫偶聯(lián) 物。用以從無細(xì)胞提取物或培養(yǎng)基回收蛋白質(zhì)（諸如結(jié)合分子）的方法為本領(lǐng)域的普通技 術(shù)人員所熟知。通過上述方法可獲得的結(jié)合分子、功能變異體和/或免疫偶聯(lián)物也是本發(fā) 明的一部分。
[0099] 可替代地，次于在宿主（諸如宿主細(xì)胞）中表達(dá)，本發(fā)明的