的PH敏感螯合劑。凍干pH敏感螯合劑可以在緩沖液中被重新溶解。根據(jù)這些實(shí)施例，緩 沖液可以是溫度敏感緩沖液。在一些實(shí)施例中，溶解的鎂離子可逆結(jié)合到PH敏感螯合劑。 根據(jù)任意上述的實(shí)施例，緩沖液的pH對(duì)于能可逆結(jié)合溶解狀態(tài)的游離鎂離子的pH敏感螯 合劑是可控的。優(yōu)選的，擴(kuò)增試劑混合物包括被PH敏感螯合劑可逆結(jié)合的溶解狀態(tài)的鎂離 子，其中溶解狀態(tài)的鎂離子產(chǎn)生自于重新溶解在溫度敏感緩沖液中的凍干鎂鹽。
[0052] 在上述方法的任意實(shí)施例中，多核苷酸的擴(kuò)增基本上可以在等溫條件下進(jìn)行。
[0053] 在上述方法的任意實(shí)施例中，多核苷酸在與擴(kuò)增試劑混合物混合前不被變性。
[0054] 在上述方法的任意實(shí)施例中，混合步驟在溫度處于約0°C至10°C之間，約10°C至 20°C之間，約20°C至30°C之間時(shí)進(jìn)行。優(yōu)選的混合步驟在溫度處于約20°C至30°C之間時(shí) 進(jìn)行。
[0055] 在上述方法的任意實(shí)施例中，多核苷酸直到反應(yīng)混合物的溫度處于約30°C至 40°C之間，約40°C至50°C之間，約50°C至60°C之間，約60°C至70°C之間，約70°C至80°C之 間，約80°C至90°C之間，或約90°C至100°C之間才能進(jìn)行擴(kuò)增。優(yōu)選的多核苷酸的擴(kuò)增直 到反應(yīng)混合物的溫度處于約50°C至60°C之間才進(jìn)行擴(kuò)增。
[0056] 在上述方法的任意實(shí)施例中，在沒有處于第一溫度和第二文件之間反應(yīng)物溫度的 重復(fù)循環(huán)時(shí)，多核苷酸的擴(kuò)增進(jìn)行。
[0057] 在上述方法的任意實(shí)施例中，擴(kuò)增試劑混合物的一種或多種成分可以被提供在適 宜流體裝置、盒式或橫向流動(dòng)裝置中使用的容器中。
[0058] 在上述方法的任意實(shí)施例中，多核苷酸的擴(kuò)增可以在沒有額外試劑添加到混合步 驟（a)中形成的反應(yīng)混合物中時(shí)進(jìn)行。
[0059] 在上述方法的任意實(shí)施例中，該方法可以進(jìn)一步包括步驟（C):檢測(cè)擴(kuò)增的多核 苷酸。在包括步驟（C)的方法的進(jìn)一步的實(shí)施例中，擴(kuò)增的多核苷酸的檢測(cè)可以在沒有額 外試劑添加到在結(jié)合步驟（a)中行程單反應(yīng)混合物中發(fā)生或進(jìn)行。
[0060] 在上述方法的任意實(shí)施例中，至少50%，至少60%，至少70%，至少80%，至少 90 %，至少95 %，或基本上所有反應(yīng)混合物中的二價(jià)離子都是可溶形式的。在進(jìn)一步的實(shí)施 例中，二價(jià)離子被pH敏感螯合劑可逆結(jié)合。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施例中，二價(jià)離子包括游離 的二價(jià)離子。在另一個(gè)實(shí)施例中，二價(jià)離子同時(shí)包括結(jié)合的和游離的二價(jià)離子。
[0061] 在上述方法的任意實(shí)施例中，溶解的二價(jià)離子不能由沉淀解離形成。
[0062] 在上述方法的任意實(shí)施例中，低于20 %，低于15 %，低于10 %，低于5 %，低于1 %， 或基本上沒有二價(jià)離子在多核苷酸擴(kuò)增前形成沉淀物。
[0063] 在包含步驟（c)的上述方法的任意實(shí)施例中，低于20%，低于15%，低于10%，低 于5 %，低于1 %，或基本上沒有二價(jià)離子在檢測(cè)擴(kuò)增的多核苷酸之前形成沉淀物。
[0064] 在上述方法的任意實(shí)施例中，反應(yīng)混合物不包括以沉淀形式結(jié)合的二價(jià)離子。
[0065] 另一方面，本發(fā)明提供一種組分，其包括用于核苷酸擴(kuò)增的一種或多種試劑和溶 解狀態(tài)下的依賴pH的可逆結(jié)合的鎂離子。
[0066] 在上述組分的任意實(shí)施例中，該組分可以進(jìn)一步包括一種溫度敏感緩沖試劑和一 種PH敏感螯合劑。在特定的實(shí)施例中，溫度敏感緩試劑可以包括三（羥甲基）氨基甲烷。 在另一個(gè)特定實(shí)施例中，pH敏感螯合劑可以包括乙二醇-雙（2-氨基乙醚）四乙酸。優(yōu)選 的，該組分進(jìn)一步包括三（羥甲基）氨基甲烷和乙二醇-雙（2-氨基乙醚）四乙酸。
[0067] 在上述組分的任意實(shí)施例中，溫度敏感緩試劑的ApKa值為-0. 04 °C η 和-0. 015°C η之間。
[0068] 在上述組分的任意實(shí)施例中，用于核苷酸擴(kuò)增的一種或多種試劑可以包括一種切 口內(nèi)切酶，一種DNA或RNA聚合酶，一種重組酶，和/或一種逆轉(zhuǎn)錄酶。在特定的實(shí)施例中， 一種或多種試劑包括一種切口內(nèi)切酶和一種DNA或RNA聚合酶。在其他實(shí)施例中，一種或 多種試劑包括一種重組酶和一種DNA或RNA聚合酶。這些實(shí)施例可以根據(jù)情況所需包括一 種逆轉(zhuǎn)錄酶。
[0069] 在上述組分的任意實(shí)施例中，用于核苷酸擴(kuò)增的一種或多種試劑包括一種或多種 凍干形式的組分。在特定的實(shí)施例中，一種或多種試劑可以包括凍干形式的鎂鹽。凍干的 鎂鹽可以在緩沖液中重新溶解來(lái)形成溶解狀態(tài)的鎂離子。在其他實(shí)施例中，一種或多種試 劑可以包括凍干形式的PH敏感螯合劑。優(yōu)選的，上述組分包括溶解狀態(tài)的能可逆結(jié)合的pH 依賴的鎂離子，其中溶解狀態(tài)的鎂離子由凍干的鎂鹽在溫度敏感緩沖液中重新溶解形成。
[0070] 在上述組分的任意實(shí)施例中，溶解的鎂離子不能由沉淀的解離形成。
[0071 ] 在上述組分的任意實(shí)施例中，組分不包括以沉淀形式結(jié)合的鎂離子。
[0072] 在上述組分的任意實(shí)施例中，一種或多種組分可以被提供在適宜流體裝置、盒式 或橫向流動(dòng)裝置中使用的容器中。
[0073] 在另一方面，本發(fā)明提供一種組分，該組分包括一種或多種用于核苷酸擴(kuò)增的試 劑、溫度敏感緩沖液，PH敏感螯合劑和鎂鹽。
[0074] 在上述組分的任意實(shí)施例中，溫度敏感緩沖液可以包括三（羥甲基）氨基甲烷。
[0075] 在上述組分的任意實(shí)施例中，溫度敏感緩沖液的ApKa值在-0.04 °C η 和-0. 015°C η之間。
[0076] 在上述組分的任意實(shí)施例中，pH敏感螯合劑可以包括乙二醇-雙（2-氨基乙醚） 四乙酸。
[0077] 優(yōu)選的，該組分包括三（羥甲基）氨基甲烷和乙二醇-雙（2-氨基乙醚）四乙酸。
[0078] 在上述組分的任意實(shí)施例中，用于核苷酸擴(kuò)增的一種或多種試劑可以包括一種切 口內(nèi)切酶，一種DNA或RNA聚合酶，一種重組酶，和/或一種逆轉(zhuǎn)錄酶。在特定的實(shí)施例中， 一種或多種試劑包括一種切口內(nèi)切酶和一種DNA或RNA聚合酶。在其他實(shí)施例中，一種或 多種試劑包括一種重組酶和一種DNA或RNA聚合酶。這些實(shí)施例可以根據(jù)情況所需包括一 種逆轉(zhuǎn)錄酶。
[0079] 在上述組分的任意實(shí)施例中，一種或多種試劑包括一種或多種凍干形式的組分。 在特定的實(shí)施例中，一種或多種試劑可以包括凍干形式的鎂鹽。凍干的鎂鹽可以在緩沖液 中重新溶解來(lái)形成溶解狀態(tài)的鎂離子。在其他實(shí)施例中，一種或多種試劑可以包括凍干形 式的PH敏感螯合劑。凍干的pH敏感螯合劑可以在緩沖液中被重新溶解。根據(jù)這些實(shí)施例， 緩沖液可以是一種溫度敏感緩沖液。優(yōu)選的，上述組分包括凍干的鎂鹽，該鎂鹽在溫度敏感 緩沖液中被重新溶解，形成溶解狀態(tài)的pH依賴可逆結(jié)合鎂離子。
[0080] 在上述組分的任意實(shí)施例中，溶解的鎂離子不能由沉淀溶解形成。
[0081] 在上述組分的任意實(shí)施例中，該組分不包括以沉淀形式被結(jié)合的鎂離子。
[0082] 在上述組分的任意實(shí)施例中，一種或多種組分可以被提供在適宜流體裝置、盒式 或橫向流動(dòng)裝置中使用的容器中。
[0083] 另一方面，本發(fā)明提供的方法包括：（a)使一種酶和一種試劑混合物混合來(lái)形成 反應(yīng)混合物，其中反應(yīng)混合物包括溶解狀態(tài)的能可逆結(jié)合的二價(jià)離子，和（b)調(diào)節(jié)反應(yīng)混 合物的PH來(lái)釋放可逆結(jié)合的二價(jià)離子，從而激活酶。
[0084] 在上述方法的任意實(shí)施例中，二價(jià)離子從下列組合中選擇：鎂、鈣、銅、鋅、錳、鐵、 錦和鉛。
[0085] 在上述方法的任意實(shí)施例中，試劑混合物可以包括一種pH敏感螯合劑。
[0086] 在上述方法的任意實(shí)施例中，試劑混合物可以包括一種溫度敏感緩沖液。
[0087] 在上述方法的任意實(shí)施例中，反應(yīng)混合物的pH值可以根據(jù)溫度敏感緩沖液的pH 值被調(diào)節(jié)。
[0088] 在上述方法的任意實(shí)施例中，反應(yīng)混合物的pH值可以通過改變反應(yīng)混合物的溫 度來(lái)調(diào)節(jié)，從第一溫度變?yōu)榈诙囟取?br>[0089] 在上述方法的任意實(shí)施例中，酶可以是一種DNA或RNA聚合酶。
[0090] 在上述方法的任意實(shí)施例中，該酶可以是一種切口內(nèi)切酶。
[0091] 本發(fā)明的方法可以包括擴(kuò)增多核苷酸的反應(yīng)，例如在基本等溫條件下或非等溫條 件下。例如擴(kuò)增反應(yīng)可以包括切口和延伸擴(kuò)增反應(yīng)（NEAR)，或重組聚合酶擴(kuò)增（RPA)。
[0092] 另一方面，本發(fā)明的特點(diǎn)是組分（如干燥的組分），這些組分包括切口內(nèi)切酶（如 N. BstNBI)，DNA聚合酶（如嗜熱DNA聚合酶），和pH敏感螯合劑（如EGTA)。在一些實(shí)施 例中，這些組分進(jìn)一步包括溫度敏感緩沖液（如Tris)。在實(shí)施例中，組分進(jìn)一步包括逆轉(zhuǎn) 錄酶。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的這些組分或方法可以包括（i)正向模板，包括在3 '端具 有可識(shí)別區(qū)域的與靶標(biāo)序列的反義鏈的3'端互補(bǔ)的核苷酸序列，切口酶結(jié)合位點(diǎn)，識(shí)別區(qū) 域的上游的切口位點(diǎn)，和上述切口位點(diǎn)上游的穩(wěn)定區(qū)域，和/或（ii)反向模板，該反向模板 在3'端具有一個(gè)與靶標(biāo)序列有義鏈的3 '端互補(bǔ)的可識(shí)別位點(diǎn)的核苷酸序列，（如互補(bǔ)的 靶標(biāo)序列反義鏈），切口酶結(jié)合位點(diǎn)，可識(shí)別區(qū)域上游的切口位點(diǎn)，和上述切口位點(diǎn)上游的 穩(wěn)定區(qū)域。在一些實(shí)施例中，這些組分能進(jìn)一步包括鎂鹽或鎂離子。
[0093] 在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的這些組分或方法可以包括一種或多種切口酶，例如， 選自下列組合：Nt. BspQI, Nb. BbvCI, Nb. BsmI, Nb. BsrDI, Nb. BtsI, Nt. AlwI, Nt. BbvCI, Nt. BstNBI, Nt. CviPII, Nb. BpulOl, Nt. BpulOI,和 N. BspD6I。在某些實(shí)施例中，切口 酶可以 選自由Nt. NBst. NBI, Nb. BsmI,和Nb. BsrDI組成的組合。優(yōu)選的切口酶是Nt. BstNBI或 N.BspD6I。本領(lǐng)域的這些普通技術(shù)人員都知道除了這里特別提到的切口酶，其他各種切口 酶都可以在本發(fā)明的方法和組分中使用。
[0094] 在本發(fā)明的方法和組分的一些實(shí)施例中可以包括模板，該模板可以是寡核苷酸， 其可以與靶標(biāo)的可識(shí)別區(qū)域結(jié)合，也可以包含可識(shí)別區(qū)域上游的切口酶結(jié)合區(qū)域和切口酶 結(jié)合區(qū)域上游的穩(wěn)定區(qū)域。這個(gè)"可識(shí)別區(qū)域"可以是模板上與靶標(biāo)序列的核苷酸序列互 補(bǔ)的核苷酸序列。這個(gè)靶序列上的可識(shí)別區(qū)域可以是靶序列上與模板互補(bǔ)，結(jié)合的核苷酸 序列。這個(gè)"穩(wěn)定區(qū)域"可以是一個(gè)核苷酸序列，該序列具有，例如約50% GC含量，被設(shè)計(jì) 來(lái)用來(lái)，例如，在切口和/或擴(kuò)增反應(yīng)中來(lái)穩(wěn)定分子。
[0095] 另一方面，本發(fā)明的特定在于組分（如干燥的組分）包括一種重組酶（如UvsX)， 一種DNA聚合酶，和pH敏感螯合劑（如EGTA)。在一些實(shí)施例中，組分進(jìn)一步包括一種溫度 敏感緩沖液（如Tris)。本發(fā)明的這些組分或方法可以包括一種或多種（i)單鏈DNA結(jié)合 蛋白（如gp32)，（ii)UvsY，和（iii)擁擠試劑（如聚乙二醇（PEG))。在一些實(shí)施例中，這 些組分進(jìn)一步包括鎂鹽或鎂離子。在一些實(shí)施例中優(yōu)選的本發(fā)明的組分和方法包括工程化 的和修飾過的重組酶的同工酶，例如大腸桿菌recA和T4卩莖菌體uvsX，聚合酶包括大腸桿菌 DNA聚合酶I Klenow片段，Bst聚合酶，Phi-29聚合酶，枯草桿菌Pol I (Bsu)，PolV和來(lái)自 大腸桿菌和T4 (如gp32蛋白）的單鏈DNA結(jié)合蛋白。
[0096] 標(biāo)記的探針能與多核苷酸或擴(kuò)增的多核苷酸產(chǎn)物有效的互補(bǔ)和雜交，這些探針被 用于本發(fā)明的任何方面或?qū)嵤├小?br