47. 在權(quán)利要求45或46的方法中，其中溫度敏感緩沖液包括三（羥甲基）氨基甲烷。
48. 在權(quán)利要求45-47的任意方法中，其中在第二溫度時(shí)溫度敏感緩沖液的pKa值少于 第一溫度時(shí)溫度敏感緩沖液的pKa值的至少0. 4。
49. 在權(quán)利要求45-48的任意方法中，其中溫度敏感緩沖液的ApKa值在-0. 04°C 和-0. 015°Ch之間。
50. 在權(quán)利要求45-49的任意方法中，其中第一溫度在約0°C至10°C之間，約10°C至 20°C之間，或約20°C至30°C之間。
51. 在權(quán)利要求45-50的任意方法中，其中第二溫度在約30°C至40°C之間，約40°C至 50°C之間，約50°C至60°C之間，約60°C至70°C之間，約70°C至80°C之間，約80°C至90°C之 間，或約90°C至100°C之間。
52. 在權(quán)利要求45-51的任意方法中，其中擴(kuò)增試劑混合物包括一種切口內(nèi)切酶。
53. 在權(quán)利要求45-52的任意方法中，其中擴(kuò)增試劑混合物包括一種DNA或RNA聚合 酶。
54. 在權(quán)利要求45-53的任意方法中，其中擴(kuò)增試劑混合物包括一種逆轉(zhuǎn)錄酶。
55. 在權(quán)利要求45-54的任意方法中，其中螯合劑濃度與鎂離子濃度的比值約為0. 5至 2之間。
56. 在權(quán)利要求45-55的任意方法中，其中第一溫度時(shí)游離的鎂離子濃度為約0至 10mM之間。
57. 在權(quán)利要求45-56的任意方法中，其中第二溫度時(shí)游離的鎂離子濃度為約5至 50mM之間。
58. 在權(quán)利要求45-57的任意方法中，其中擴(kuò)增試劑混合物包括一種或多種凍干形式 的組分。
59. 在權(quán)利要求45-58的任意方法中，其中擴(kuò)增試劑混合物包括凍干形式的鎂鹽。
60. 在權(quán)利要求45-59的任意方法中，其中擴(kuò)增試劑混合物包括一種凍干形式的pH敏 感螯合劑。
61. 在權(quán)利要求59的方法中，其中凍干的鎂鹽被重新溶解在緩沖液中形成溶解狀態(tài)的 鎂咼子。
62. 在權(quán)利要求60的方法中，其中凍干的pH敏感螯合劑被重新溶解在緩沖液中。
63. 在權(quán)利要求61的方法中，其中溶解狀態(tài)的鎂離子被可逆結(jié)合在pH敏感螯合劑上。
64. 在權(quán)利要求61或62的方法中，其中緩沖液是一種溫度敏感緩沖液。
65. 在權(quán)利要求61-64的任意方法中，其中，對(duì)于pH敏感螯合劑與溶解狀態(tài)的游離鎂離 子可逆結(jié)合，緩沖液的pH是可操控的，。
66. 在權(quán)利要求45-65的任意方法中，其中多核苷酸的擴(kuò)增在基本等溫條件下進(jìn)行。
67. 在權(quán)利要求45-66的任意方法中，其中多核苷酸在與擴(kuò)增試劑混合物結(jié)合之前不 被變性。
68. 在權(quán)利要求45-67的任意方法中，其中混合步驟發(fā)生在溫度處于約0°C至10°C之 間，約10°C至20°C之間，或約20°C至30°C之間。
69. 在權(quán)利要求45-68的任意方法中，其中，多核苷酸的擴(kuò)增直到反應(yīng)混合物的溫度為 約30 °C至40 °C之間，約40 °C至50 °C之間，約50 °C至60 °C之間，約60 °C至70 °C之間，約70 °C 至80°C之間，約80°C至90°C之間，或約90°C至100°C之間才發(fā)生擴(kuò)增。
70. 在權(quán)利要求45-69的任意方法中，其中在反應(yīng)混合物的溫度沒有在第一溫度和第 二溫度之間重復(fù)循環(huán)時(shí)，多核苷酸的擴(kuò)增可以進(jìn)行。
71. 在權(quán)利要求45-70的任意方法中，其中擴(kuò)增試劑混合物的一種或多種組分被提供 在適宜流體裝置、盒式或橫向流動(dòng)裝置中使用的容器中。
72. 在權(quán)利要求45-71的任意方法中，其中，在沒有額外的試劑添加到在混合步驟（a) 中形成的反應(yīng)混合物中時(shí)，多核苷酸的擴(kuò)增可以發(fā)生。
73. 在權(quán)利要求45-72的任意方法中，進(jìn)一步包括步驟（c):檢測擴(kuò)增的多核苷酸。
74. 在權(quán)利要求73的方法中，其中在沒有額外的試劑加入混合步驟（a)中形成的反應(yīng) 混合物時(shí)，擴(kuò)增的多核苷酸的檢測可以進(jìn)行。
75. 在權(quán)利要求45-74的任意方法中，其中至少50 %，至少60 %，至少70 %，至少80 %， 至少90%，至少95%，或基本上反應(yīng)混合物中的所有二價(jià)離子是可溶形式的。
76. 在權(quán)利要求75的方法中，其中鎂離子被可逆結(jié)合到一種pH敏感螯合劑上。
77. 在權(quán)利要求75的方法中，其中鎂離子包括游離的鎂離子。
78. 在權(quán)利要求75的方法中，其中鎂離子同時(shí)包括游離的和被結(jié)合的鎂離子。
79. 在權(quán)利要求45-78的任意方法中，其中可溶形式的鎂離子不能來自沉淀的溶解。
80. 在權(quán)利要求45-79的任意方法中，其中，在多核苷酸擴(kuò)增前，少于20%，少于15%， 少于10%，少于5%，少于1%，或基本是沒有鎂離子形成沉淀。
81. 在權(quán)利要求73的方法中，其中在檢測擴(kuò)增的多核苷酸前，少于20%，少于15%，少 于10%，少于5%，少于1%，或基本是沒有鎂離子形成沉淀。
82. 在權(quán)利要求45-81的任意方法中，其中反應(yīng)混合物不包括被結(jié)合在沉淀形式中的 鎂咼子。
83. -種組分包括用于核苷酸擴(kuò)增的一種或多種試劑和依賴pH的溶解狀態(tài)的可逆結(jié) 合的鎂離子。
84. 在權(quán)利要求83的組分中，進(jìn)一步包括一種溫度敏感緩沖液和一種pH敏感螯合劑。
85. 在權(quán)利要求84的組分中，其中溫度敏感緩沖液包括三（羥甲基）氨基甲烷。
86. 在權(quán)利要求84或85的組分中，其中溫度敏感緩沖液的ApKa值在-0.04°C 一1 和-0. 015°Ch之間。
87. 在任何一個(gè)權(quán)利要求84-86的組分中，其中pH敏感螯合劑是乙二醇-雙（2-氨基 乙醚）四乙酸。
88. 在任何一個(gè)權(quán)利要求83-87的組分中，其中用于核苷酸擴(kuò)增的一種或多種試劑包 括一種切口內(nèi)切酶。
89. 在任何一個(gè)權(quán)利要求83-88的組分中，其中用于核苷酸擴(kuò)增的一種或多種試劑包 括一種DNA或RNA聚合酶。
90. 在任何一個(gè)權(quán)利要求83-89的組分中，其中用于核苷酸擴(kuò)增的一種或多種試劑包 括一種逆轉(zhuǎn)錄酶。
91. 在任何一個(gè)權(quán)利要求83-90的組分中，其中用于核苷酸擴(kuò)增的一種或多種試劑包 括一種重組酶。
92. 在任何一個(gè)權(quán)利要求83-91的組分中，其中用于核苷酸擴(kuò)增的一種或多種試劑包 括一種或多種凍干形式的組分。
93. 在任何一個(gè)權(quán)利要求83-92的組分中，其中用于核苷酸擴(kuò)增的一種或多種試劑包 括凍干形式的鎂鹽。
94. 在任何一個(gè)權(quán)利要求83-93的組分中，其中用于核苷酸擴(kuò)增的一種或多種試劑包 括凍干形式的pH敏感螯合劑。
95. 在權(quán)利要求93的組分中，其中凍干形式的鎂鹽被重溶在緩沖液中形成溶解狀態(tài)的 鎂咼子。
96. 在權(quán)利要求94的組分中，其中凍干形式的pH敏感螯合劑被重溶在緩沖液中。
97. 在權(quán)利要求95或96的組分中，其中緩沖液是溫度敏感緩沖液。
98. 在任何一個(gè)權(quán)利要求83-97的組分中，其中溶解狀態(tài)的鎂離子不能來自沉淀的重 溶。
99. 在任何一個(gè)權(quán)利要求83-98的組分中，其中該組分不包括以沉淀形式被結(jié)合的鎂 離子。
100. 在任何一個(gè)權(quán)利要求83-99的組分中，其中一種或多種組分被提供在適宜于流動(dòng) 裝置、盒式或橫向流動(dòng)裝置中使用的容器中。
101. 組分包括用于核苷酸擴(kuò)增的一種或多種試劑，溫度敏感緩沖液，pH敏感螯合劑和 鎂鹽。
102. 在權(quán)利要求101的組分中，其中溫度敏感緩沖液包括三（羥甲基）氨基甲烷。
103. 在權(quán)利要求101或102的組分中，其中溫度敏感緩沖液的ApKa值在-0. 04°C ―1 和-0. 015°Ch之間。
104. 在任何一個(gè)權(quán)利要求101-103的組分中，其中溫度敏感螯合劑是乙二醇-雙 (2-氨基乙醚）四乙酸。
105. 在任何一個(gè)權(quán)利要求101-104的組分中，其中用于核苷酸擴(kuò)增的一種或多種試劑 包括一種切口內(nèi)切酶。
106. 在任何一個(gè)權(quán)利要求101-105的組分中，其中用于核苷酸擴(kuò)增的一種或多種試劑 包括一種DNA或RNA聚合酶。
107. 在任何一個(gè)權(quán)利要求101-106的組分中，其中用于核苷酸擴(kuò)增的一種或多種試劑 包括一種逆轉(zhuǎn)錄酶。
108. 在任何一個(gè)權(quán)利要求101-107的組分中，其中用于核苷酸擴(kuò)增的一種或多種試劑 包括一種重組酶。
109. 在任何一個(gè)權(quán)利要求101-108的組分中，其中用于核苷酸擴(kuò)增的一種或多種試劑 包括一種或多種凍干形式的組分。
110. 在任何一個(gè)權(quán)利要求101-109的組分中，其中該鎂離子為凍干形式的。
111. 在任何一個(gè)權(quán)利要求101-110的組分中，pH敏感螯合劑為凍干形式的。
112. 在權(quán)利要求110的組分中，其中凍干的鎂鹽被重溶在緩沖液中形成溶解狀態(tài)的鎂 離子。
113. 在權(quán)利要求111的組分中，其中凍干的pH敏感螯合劑被重溶在緩沖液中。
114. 在權(quán)利要求112或113的組分中，其中緩沖液是一種溫度敏感緩沖液。
115. 在權(quán)利要求112的組分中，其中溶解狀態(tài)的鎂離子不能來自沉淀的重溶。
116. 在任何一個(gè)權(quán)利要求101-115的組分中，其中組分不包括以沉淀形式被結(jié)合的鎂 離子。
117. 在任何一個(gè)權(quán)利要求101-115的組分中，其中一種或多種組分被提供在適宜于流 動(dòng)裝置、盒式或橫向流動(dòng)裝置中使用的容器中。
118. 方法包括 (a) 使酶和試劑混合物混合形成反應(yīng)混合物，其中反應(yīng)混合物包括溶解狀態(tài)的可逆結(jié) 合的二價(jià)離子，和 (b) )調(diào)節(jié)反應(yīng)混合物的pH來釋放可逆結(jié)合的二價(jià)離子。 從而激活酶。
119. 在權(quán)利要求118的方法中，其中二價(jià)離子被選自下列組合：鎂、該、銅、鋅、錳、鐵、 錦和鉛。
120. 在權(quán)利要求118或119的方法中，其中試劑混合物包括一種pH敏感螯合劑。
121. 在任何一個(gè)權(quán)利要求118-120的方法中，其中試劑混合物包括一種溫度敏感緩沖 液。
122. 在權(quán)利要求121的方法中，其中反應(yīng)混合物的pH根據(jù)溫度敏感緩沖液的pH來調(diào) T。
123. 在任何一個(gè)權(quán)利要求118-122的方法中，其中反應(yīng)混合物的pH通過改變反應(yīng)混合 物的溫度來調(diào)節(jié)，從第一溫度變?yōu)榈诙囟取?br>124. 在任何一個(gè)權(quán)利要求118-123的方法中，其中酶是一種DNA或RNA聚合酶。
125. 在任何一個(gè)權(quán)利要求118 - 123的方法中，其中酶是一種切口內(nèi)切酶。
【專利摘要】方法包括使一種多核苷酸與一種擴(kuò)增試劑混合物混合形成一種反應(yīng)混合物，其中反應(yīng)混合物包括在溶解狀態(tài)下的能可逆結(jié)合的二價(jià)離子，和調(diào)節(jié)反應(yīng)混合物的pH來釋放可逆結(jié)合的二價(jià)離子，從而啟動(dòng)多核苷酸的擴(kuò)增。
【IPC分類】C07H21-04, C12P19-34, C12Q1-68
【公開號(hào)】CN104662159
【申請?zhí)枴緾N201380029231
【發(fā)明人】張宏華, 佳露·蒲偉德, 瑞查德·若斯
【申請人】愛奧尼安技術(shù)公司
【公開日】2015年5月27日
【申請日】2013年6月7日
【公告號(hào)】CA2876159A1, EP2859111A1, US20130330777, WO2013185081A1