用于癌癥檢測的血漿dna突變分析的制作方法
【專利說明】用于癌癥檢測的血漿DNA突變分析
[0001] 相關(guān)申請的奪叉引用
[0002] 本申請是2012年6月21日提交的標(biāo)題是"用于癌癥檢測的血漿DNA突變分析 (MUTATIONAL ANALYSIS OF PLASMA DNA FOR CANCER DETECTION)" 的美國臨時專利申請第 61/662,878號、2012年8月13日提交的標(biāo)題是"用于癌癥檢測的血漿DNA突變分析"的美 國臨時專利申請第61/682, 725號、2012年8月31日提交的標(biāo)題是"用于癌癥檢測的血漿 DNA突變分析"的美國臨時專利申請第61/695, 795號、和2012年10月8日提交的標(biāo)題是 "用于癌癥檢測的血漿DNA突變分析"的美國臨時專利申請第61/711，172號的非臨時申請， 并且要求所述臨時專利申請的權(quán)益，所述臨時專利申請以全文引用的方式并入本文中用于 所有目的。
【背景技術(shù)】
[0003] 已經(jīng)顯示，腫瘤來源的DNA存在于癌癥患者的無細(xì)胞的血漿/血清中（陳XQ (Chen XQ)等人自然醫(yī)學(xué)（Nat Med) 1996;2:1033-1035)。大多數(shù)現(xiàn)行方法基于對已知與癌癥相 關(guān)的突變進(jìn)行直接分析（迪爾F(Diehl F)等人美國國家科學(xué)院院刊（Proc Natl Acad Sci) 2005; 102:16368-16373;弗休 T(Forshew T)等人科學(xué)?轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)（Sci Transl Med) 2012 ;4:136ra68)。另一種方法已經(jīng)研究了通過對血漿DNA進(jìn)行隨機(jī)測序而檢測的癌 癥相關(guān)基因組拷貝數(shù)變異（洛（Lo)等人的美國專利公開2013/0040824)。
[0004] 已知隨著時間，多于一種癌細(xì)胞將獲得生長優(yōu)勢并且產(chǎn)生多個子代細(xì)胞克隆。 最終，腫瘤的生長和/或其轉(zhuǎn)移灶將含有多種克隆癌細(xì)胞群的聚結(jié)物。此現(xiàn)象典型地稱 為腫瘤異質(zhì)性（格林杰M(Gerlinger M)等人新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志（N Engl J Med)2012; 366:883-892 ;葉 TA (Yap TA)等人科學(xué)?轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué) 2012 ;4:127psl0)。
[0005] 已知癌癥是高度異質(zhì)的，即相同組織類型的癌癥的突變分布可以大幅變化。因此， 對特定突變進(jìn)行直接分析典型地僅可以檢測已知與那些特定突變相關(guān)的特定癌癥類型內(nèi) 的病例的子集。另外，腫瘤來源的DNA通常是人類血漿中DNA的微量物質(zhì)；血漿中DNA的絕 對濃度低。因此，即使在患有已知具有標(biāo)靶突變的癌癥的患者中，直接檢測血漿或血清中某 一或某一小批癌癥相關(guān)的突變也可能會獲得低分析敏感性。此外，已經(jīng)顯示，即使在單一腫 瘤內(nèi)就突變來說也存在顯著瘤內(nèi)異質(zhì)性。突變可以僅見于腫瘤細(xì)胞的亞群中。原發(fā)性腫瘤 與轉(zhuǎn)移性病變之間的突變分布差異甚至更大。一個關(guān)于瘤內(nèi)和原發(fā)性-轉(zhuǎn)移性間的異質(zhì)性 的實(shí)例包括罹患結(jié)腸直腸癌的患者中的KRAS、BRAF和PIK3CA基因（巴爾杜斯（Baldus)等 人臨床癌癥研究（Clin Cancer Research) 2010. 16:790-9·)。
[0006] 在其中患者具有原發(fā)性腫瘤（攜帶KRAS突變但無 PIK3CA突變）和隱蔽轉(zhuǎn)移性病 變（攜帶PIK3CA突變但無 KRAS突變）的情形下，如果集中于檢測原發(fā)性腫瘤中的KRAS突 變，那么無法檢測隱蔽轉(zhuǎn)移性病變。然而，如果在分析中包括兩種突變，那么可以檢測原發(fā) 性腫瘤和隱蔽轉(zhuǎn)移性病變兩者。因此，包括兩種突變的測試在殘余腫瘤組織的檢測中將具 有更高敏感性。當(dāng)針對癌癥進(jìn)行篩選時，當(dāng)擁有極少或不擁有關(guān)于可能出現(xiàn)的突變類型的 信息，這種簡單實(shí)例變得更復(fù)雜。
[0007] 因此需要提供新技術(shù)，以便針對癌癥執(zhí)行廣泛篩選、檢測或評估。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 實(shí)施方案可以觀察經(jīng)歷針對癌癥的篩選或監(jiān)測的受試者的生物樣品（例如血漿 或血清）中的體細(xì)胞突變頻率，當(dāng)與同一受試者的組成型DNA中的體細(xì)胞突變頻率相比時。 可以使用隨機(jī)測序來測定這些頻率。參數(shù)可以來源于這些頻率并且用以確定癌癥等級的分 類?？梢酝ㄟ^要求任何變異基因座都具有至少規(guī)定數(shù)目的變異序列讀?。?biāo)簽）來將假陽 性過濾掉，由此提供更準(zhǔn)確的參數(shù)?？梢苑治霾煌儺惢蜃南鄬︻l率以測定患者中腫 瘤的異質(zhì)性等級。
[0009] 在一個實(shí)施方案中，可以將參數(shù)與來源于一組不患有癌癥或具有低癌癥風(fēng)險的受 試者的相同參數(shù)比較。獲自測試受試者的參數(shù)與來自不患有癌癥或具有低癌癥風(fēng)險的受試 者群組的參數(shù)的顯著差異可以表明，測試受試者患有癌癥或癌變前病況或在將來將患上癌 癥的風(fēng)險增加。因此，在一個實(shí)施方案中，可以在無腫瘤的先前基因組信息的情況下進(jìn)行血 漿DNA分析。這種實(shí)施方案因此尤其適用于篩選癌癥。
[0010] 在另一個實(shí)施方案中，實(shí)施方案還可以用于監(jiān)測治療后的癌癥患者并且查看是否 存在殘余腫瘤或腫瘤是否已經(jīng)復(fù)發(fā)。舉例來說，具有殘余腫瘤或腫瘤已經(jīng)復(fù)發(fā)的患者將具 有比不存在殘余腫瘤或未觀察到腫瘤復(fù)發(fā)的患者中更高的體細(xì)胞突變頻率。所述監(jiān)測可以 包括在治療后的多個時間點(diǎn)從癌癥患者獲得樣品，以便確定體液或具有無細(xì)胞的核酸的其 它樣品（例如血漿或血清）中腫瘤相關(guān)的遺傳畸變的時間變化。
[0011] 根據(jù)一個實(shí)施方案，一種方法檢測受試者中的癌癥或癌變前變化。獲得受試者的 組成型基因組。接收受試者的生物樣品中的多個DNA片段中每一個的一個或多個序列標(biāo) 簽，其中生物樣品包括無細(xì)胞的DNA。測定序列標(biāo)簽的基因組位置。將序列標(biāo)簽與組成型基 因組比較以測定某第一基因座的第一數(shù)目。在每個第一基因座處，相對于組成型基因組具 有變異序列的序列標(biāo)簽的數(shù)目高于某一截止值，其中截止值大于一。基于在第一基因座處 具有變異序列的序列標(biāo)簽的數(shù)目測定參數(shù)。將參數(shù)與閾值比較以確定受試者中癌癥等級的 分類。
[0012] 根據(jù)另一個實(shí)施方案，一種方法分析受試者的一或多個腫瘤的異質(zhì)性。獲得受試 者的組成型基因組。接收受試者的生物樣品中的多個DNA片段中每一個的一個或多個序列 標(biāo)簽，其中生物樣品包括無細(xì)胞的DNA。測定序列標(biāo)簽的基因組位置。將序列標(biāo)簽與組成型 基因組比較以測定第一基因座的第一數(shù)目。在每個第一基因座處，相對于組成型基因組具 有變異序列的序列標(biāo)簽的數(shù)目高于某一截止值，其中截止值大于一?；诘谝换蚪M位置 集的各自第一數(shù)目計算一或多個腫瘤的異質(zhì)性的度量。
[0013] 根據(jù)另一個實(shí)施方案，一種方法測定包括無細(xì)胞的DNA的生物樣品中的腫瘤DNA 的百分比濃度。接收生物樣品中的多個DNA片段中的每一個的一個或多個序列標(biāo)簽。測定 序列標(biāo)簽的基因組位置。對于多個基因組區(qū)域中的每一者，由在基因組區(qū)域內(nèi)具有基因組 位置的序列標(biāo)簽測定基因組區(qū)域內(nèi)DNA片段的各自的量。將各自的量標(biāo)準(zhǔn)化以獲得各自的 密度。將各自的密度與參考密度比較以鑒別基因組區(qū)域是展現(xiàn)出1拷貝損失還是1拷貝增 加。由鑒別為展現(xiàn)1拷貝損失的各自的密度或由鑒別為展現(xiàn)1拷貝增加的各自的密度計算 第一密度。通過將第一密度與另一個密度比較以獲得差別來計算百分比濃度，其中將差別 用參考密度標(biāo)準(zhǔn)化。
[0014] 其它實(shí)施方案涉及與本文中所描述的方法相關(guān)的系統(tǒng)和計算機(jī)可讀介質(zhì)。
[0015] 可以參考以下【具體實(shí)施方式】和附圖獲得對本發(fā)明的本質(zhì)和優(yōu)勢的更佳理解。
【附圖說明】
[0016] 圖1是根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案檢測受試者中的癌癥或癌變前變化的方法100的流 程圖。
[0017] 圖2展示了根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案將樣品基因組（SG)直接與組成型基因組（CG) 比較的方法的流程圖。
[0018] 圖3展示了根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案使用參考基因組（RG)將樣品基因組（SG)與組 成型基因組（CG)比較的方法300的流程圖。
[0019] 圖4是表400,其展示當(dāng)假定樣品中的腫瘤來源的DNA的百分比濃度是10%時，根 據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案使用不同出現(xiàn)數(shù)目作為對樣品中所存在的突變分類的標(biāo)準(zhǔn)正確鑒別 的癌癥相關(guān)的單核苷酸突變的數(shù)目。
[0020] 圖5是表，其展示當(dāng)假定樣品中的腫瘤來源的DNA的百分比濃度是5 %時鑒別的假 陽性基因座的預(yù)期數(shù)目和突變的預(yù)期數(shù)目。
[0021] 圖6A是圖表600，其展示腫瘤來源的DNA的血漿百分比濃度是10 %和20 %的血漿 中的癌癥相關(guān)的突變的檢測率并且使用四次和六次出現(xiàn)（r)作為呼叫潛在癌癥相關(guān)的突 變的準(zhǔn)則。圖6B是圖表650,其展示相對于測序不同測序深度的錯誤分類，其分別使用突變 核酸出現(xiàn)次數(shù)（r)4、5、6和7作為識別突變位點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)。
[0022] 圖7A是圖表700,其展示當(dāng)假定樣品中的腫瘤來源的DNA的百分比濃度是5%時 真實(shí)癌癥相關(guān)的突變位點(diǎn)和假陽性位點(diǎn)的數(shù)目相對于不同測序深度的變化。圖7B是圖表 750,其展示假陽性位點(diǎn)的預(yù)測數(shù)目，包括分析全基因組（WG)和所有外顯子。
[0023] 圖8是表800,其展示根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案4名HCC患者在治療前后的結(jié)果，包 括血漿中的腫瘤來源的DNA的百分比濃度。
[0024] 圖9是表900,其展示根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案檢測16名健康對照受試者中的HCC 相關(guān)的SNV。
[0025] 圖IOA展示了根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案HCC患者的腫瘤樣品的序列讀取密度的分布 圖。圖IOB展示了根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案HCC患者的血漿中的所有基因組區(qū)段的z分?jǐn)?shù)的 分布圖1050。
[0026] 圖11展示了根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案HCC患者的血漿的z分?jǐn)?shù)的分布圖1100。
[0027] 圖12是根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案測定包括無細(xì)胞的DNA的生物樣品中的腫瘤DNA 的百分比濃度的方法1200的流程圖。
[0028] 圖13A展示了根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案在診斷時分析患有卵巢癌和乳癌的患者的 血漿中的突變的表1300。
[0029] 圖13B展示了根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案關(guān)于患有雙側(cè)卵巢癌和乳癌患者，分析在腫 瘤切除之后的血漿中的突變的表1350。
[0030] 圖14A是展示檢測HCCl的血漿DNA中的單核苷酸變異的表1400。圖14B是展示 檢測HCC2的血漿DNA中的單核苷酸變異的表1450。
[0031] 圖15A是展示檢測HCC3的血漿DNA中的單核苷酸變異的表1500。圖15B是展示 檢測HCC4的血漿DNA中的單核苷酸變異的表1550。
[0032] 圖16是展示檢測患有卵巢癌（和乳癌）的患者的血漿DNA中的單核苷酸變異的 表 1600。
[0033] 圖17是展示突變出現(xiàn)頻率的不同要求和不同測序深度所對應(yīng)的預(yù)測敏感性的表 1700。
[0034] 圖18是展示針對不同截止值和不同測序深度所對應(yīng)的假陽性基因座的預(yù)測數(shù)目 的表1800。
[0035] 圖19展示了說明不同腫瘤位點(diǎn)檢測到的突變數(shù)目的樹圖。
[0036] 圖20是表2000,其展示治療前和治療后血漿樣品中攜帶腫瘤來源的突變的片段 的數(shù)目。
[0037] 圖21是圖表2100,其展示血漿中單一腫瘤位點(diǎn)檢測到的突變和所有四個腫瘤位 點(diǎn)都檢測到的突變的出現(xiàn)頻率分布。
[0038] 圖22是圖表2200,其展示血漿中來自異質(zhì)腫瘤的突變的預(yù)測出現(xiàn)頻率分布。
[0039] 圖23展現(xiàn)了本發(fā)明的實(shí)施方案在16名招募的健康對照受試者中特異性。
[0040] 圖24是根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案分析受試者的一或多個腫瘤的異質(zhì)性的方法2400 的流程圖。
[0041] 圖25展示了可與根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的系統(tǒng)和方法一起使用的例示性計算機(jī) 系統(tǒng)2500的框圖。
【具體實(shí)施方式】
[0042] 定義
[0043] 如本文中所用，術(shù)語"基因座（locus)"或其復(fù)數(shù)形式"基因座（loci)"是任何長 度的核苷酸（或堿基對）的位置或地址，其可以在越基因組中具有變化。"區(qū)間（bin)"是 基因組中的預(yù)定長度的區(qū)域。多個區(qū)間可以具有相同第一長度（分辨率），而不同多個可以 具有相同第二長度。