部分用計(jì) 算機(jī)系統(tǒng)執(zhí)行，所述計(jì)算機(jī)系統(tǒng)包括一或多個(gè)處理器。
[0067] 在步驟110中，獲得受試者的組成型基因組?？梢杂伤鶞y試的受試者的組成型DNA 測定組成型基因組（CG)。在各種實(shí)施方案中，CG可以由存儲器讀取或例如通過分析組成型 DNA的序列讀取而有效測定，所述組成型DNA可以在來自包括無細(xì)胞的DNA的樣品的細(xì)胞 中。舉例來說，當(dāng)懷疑非血液惡性病時(shí),可以分析血細(xì)胞以測定受試者的組成DNA。
[0068] 在各種實(shí)施方案中，對組成型DNA的分析可以使用大規(guī)模平行測序、基于陣列的 雜交、基于探針的溶液中雜交、基于連接的分析、引物延伸反應(yīng)分析和質(zhì)譜分析來執(zhí)行。在 一個(gè)實(shí)施方案中，CG可以在受試者生命的一個(gè)時(shí)間點(diǎn)、例如在出生時(shí)或甚至產(chǎn)前時(shí)期中測 定（其可以使用胎兒細(xì)胞或經(jīng)由無細(xì)胞的DNA片段進(jìn)行，參看美國公開2011/0105353)，并 且然后當(dāng)在受試者生命的其它時(shí)間獲得體液或其它樣品時(shí)被參考。因此，CG可以簡單地由 計(jì)算機(jī)存儲器讀取。組成型基因組可以讀出為基因座列表，其中組成型基因組不同于參考 基因組。
[0069] 在步驟120中，對于受試者的生物樣品中的多個(gè)DNA片段中的每一者，獲得一或多 種序列標(biāo)簽，其中生物樣品包括無細(xì)胞的DNA。在一個(gè)實(shí)施方案中，由對生物樣品中的DNA 片段進(jìn)行隨機(jī)測序產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)序列標(biāo)簽。當(dāng)執(zhí)行雙末端測序時(shí)，可以獲得多于一種序 列標(biāo)簽。一種標(biāo)簽將對應(yīng)于DNA片段的每個(gè)末端。
[0070] 可以分析樣品（例如血漿、血清或其它體液）中的無細(xì)胞的DNA以對遺傳變異檢 索?？梢允褂门c已經(jīng)用于分析組成DNA的平臺相同的分析平臺分析無細(xì)胞的DNA?；蛘?，可 以使用不同分析平臺。舉例來說，可以使用大規(guī)模平行測序?qū)o細(xì)胞的DNA樣品測序，或可 以在大規(guī)模平行測序之前捕獲基因組的部分或使其富集。如果使用富集，那么可以例如使 用基因組的所選部分的液相或固相捕獲。然后，可以對所捕獲的DNA進(jìn)行大規(guī)模平行測序。
[0071] 在步驟130中，測定序列標(biāo)簽的基因組位置。在一個(gè)實(shí)施方案中，將序列標(biāo)簽與參 考基因組比對，所述參考基因組獲自一或多名其它受試者。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將基因組 序列標(biāo)簽與所測試的受試者的組成基因組比對?？梢允褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)、例 如使用局部序列基本搜索工具（BLAST)執(zhí)行比對。
[0072] 在步驟140中，測定基因座的第一數(shù)目，其中至少N個(gè)序列標(biāo)簽相對于組成基因組 (CG)具有變異序列。N等于或大于二。如下文更詳細(xì)論述，可以通過使N等于2、3、4、5或 更高來去除測序錯(cuò)誤以及細(xì)胞中隨機(jī)出現(xiàn)的體細(xì)胞突變（例如由于細(xì)胞分裂）。滿足一或 多個(gè)規(guī)定準(zhǔn)則的基因座可以鑒別為突變（變異體）或突變基因座（變異基因座），然而具有 變異體但不滿足一個(gè)或多個(gè)準(zhǔn)則的基因座（例如如僅一個(gè)變異序列標(biāo)簽）稱為潛在或推定 的突變。序列變異體可以針對僅一個(gè)核苷酸或多個(gè)核苷酸。
[0073] N可以測定為基因座的總標(biāo)簽的百分比，與絕對值相對。舉例來說，當(dāng)由變異體讀 取推斷的腫瘤DNA的相對百分比濃度測定為等于或大于10% (或某一其它百分比）時(shí)，可 以鑒別變異基因座。換句話說，當(dāng)基因座由200個(gè)序列讀取覆蓋時(shí)，可能需要至少10個(gè)序 列讀取展示變異等位基因的標(biāo)準(zhǔn)來將變異體界定為突變。變異等位基因的10個(gè)序列讀取 和野生型等位基因的190個(gè)讀取將得到10% (2X1(V(10+190))的腫瘤DNA百分比濃度。
[0074] 在一個(gè)實(shí)施方案中，可以將序列標(biāo)簽（統(tǒng)稱為樣品基因組）直接與CG比較以測定 變異體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過參考基因組（RG)將樣品基因組（SG)與CG比較以測定 變異體。舉例來說，可以將CG和SG兩者與RG比較以測定展現(xiàn)變異體的基因座的分別的數(shù) 目（例如集），并且然后可以取得差值以獲得基因座的第一數(shù)目。第一數(shù)目可以簡單地以數(shù) 目形式獲得或可以對應(yīng)于一套特定基因座的集合，其然后可以經(jīng)進(jìn)一步分析以由第一基因 座處的序列標(biāo)簽測定參數(shù)。
[0075] 在一個(gè)實(shí)施方案中，將組成型DNA和血漿DNA的測序結(jié)果比較以確定單核苷酸突 變是否存在于血漿DNA中。可以分析組成型DNA純合子的區(qū)域。出于說明的目的，假定特 定基因座的基因型在組成型DNA中是純合子并且是AA。然后在血漿中，不是A的等位基因 的存在將指示在特定基因座處可能存在單核苷酸突變（SNM)。指示可能存在SNM的基因座 可以形成步驟140中基因座的第一數(shù)目。
[0076] 在一個(gè)實(shí)施方案中，可以適用的是靶向基因組的已知在特定癌癥類型中或在所述 群體的特定子集中特別易于遭受突變的部分。與后一方面相關(guān)地，實(shí)施方案可以尋找特定 群體組中特別普遍的突變類型，例如是B型肝炎病毒（對于肝癌）或人乳頭瘤病毒（對于 宮頸癌）的攜帶者的或具有傾向于體細(xì)胞突變的遺傳因子的受試者或者在DNA錯(cuò)配修復(fù)基 因中具有種系突變的受試者中尤其常見的突變。所述技術(shù)還將適用于針對具有BRCAl或 BRCA2突變的受試者的卵巢癌和乳癌中的突變進(jìn)行篩選。所述技術(shù)類似地將適用于針對具 有APC突變的受試者的結(jié)腸直腸癌中的突變進(jìn)行篩選。
[0077] 在步驟150中，基于計(jì)算在第一基因座處具有變異序列的序列標(biāo)簽的數(shù)目測定參 數(shù)。在一個(gè)實(shí)例中，參數(shù)是基因座的第一數(shù)目，其中至少N個(gè)DNA片段在基因座處相對于組 成基因組具有變異序列。因此，計(jì)數(shù)可以簡單地用以確?；蜃哂卸嘤贜個(gè)拷貝的特定 變異體被鑒別，隨后包括于第一數(shù)目中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，參數(shù)可以是或包括在第一基 因座處相對于組成基因組具有序列變異體的序列標(biāo)簽的總數(shù)目。
[0078] 在步驟160中，將受試者的參數(shù)與閾值（例如來源于一或多名其它受試者）比較 以確定受試者中癌癥等級的分類。癌癥等級的實(shí)例包括受試者是否具有癌癥還是癌變前病 況，或增加的患癌癥可能性。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以由來自受試者的先前獲得的樣品測定 閾值。
[0079] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，一或多名其它受試者可以測定為不患有癌癥或具有低癌癥 風(fēng)險(xiǎn)。因此，閾值可以是正常值、正常范圍，或指示與正常值或范圍有統(tǒng)計(jì)性顯著偏差。舉 例來說，不患有癌癥或具有低癌癥風(fēng)險(xiǎn)的受試者的血漿中相對于特定受試者的CG的可檢 測的突變數(shù)目可以用作正常范圍以確定所測試的受試者中檢測到的突變數(shù)目是否正常。在 另一個(gè)實(shí)施方案中，其它受試者可以已知患有癌癥，并且因此類似突變數(shù)目可以指示癌癥。
[0080] 在一個(gè)實(shí)施方案中，其它受試者可以經(jīng)選擇以使臨床特征與測試受試者的臨床特 征（例如性別、年齡、飲食、吸煙習(xí)慣、藥物史、先前疾病、家族史、所選基因組基因座的基因 型、病毒感染（例如B或C型肝炎病毒或人乳頭瘤病毒或人類免疫缺陷病毒或艾伯斯坦-巴 爾病毒（Epstein-Barr virus)感染）或其它傳染因子（例如細(xì)菌（例如幽門螺旋桿菌 (Helicobacter pylori))和寄生蟲（例如華支睪吸蟲（Clonorchis sinensis)))感染的狀 態(tài)等）匹配。舉例來說，是B或C型肝炎病毒的攜帶者的受試者具有增加的患上肝細(xì)胞癌的 風(fēng)險(xiǎn)。因此，具有與B或C型肝炎的攜帶者類似數(shù)目或模式的突變的測試受試者可以視為 具有增加的患上肝細(xì)胞癌的風(fēng)險(xiǎn)。另一個(gè)方面，如果使用適當(dāng)基線（即相對于另一名肝炎 患者），比另一名肝炎患者展現(xiàn)更多突變的B或C型肝炎患者可以適當(dāng)?shù)罔b別為具有更高癌 癥等級分類。類似地，是人乳頭瘤病毒感染的攜帶者的受試者具有增加的宮頸癌和頭頸癌 風(fēng)險(xiǎn)。艾伯斯坦-巴爾病毒感染已經(jīng)與鼻咽癌、胃癌、霍奇金淋巴瘤（Hodgkin's lymphoma) 和非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin's lymphoma)相關(guān)。幽門螺旋桿菌感染已經(jīng)與胃癌相關(guān)。 華支睪吸蟲感染已經(jīng)與膽管癌相關(guān)。
[0081] 監(jiān)測不同時(shí)間點(diǎn)突變數(shù)目的變化可以用于監(jiān)測癌癥進(jìn)展和治療反應(yīng)。所述監(jiān)測還 可以用以記錄癌變前病況的進(jìn)展或受試者將患上癌癥的風(fēng)險(xiǎn)的變化。
[0082] 展示變異的序列標(biāo)簽的量也可以用以監(jiān)測。舉例來說，可以使用基因座處變異體 讀取的百分比濃度。在一個(gè)實(shí)施方案中，在連續(xù)監(jiān)測期間樣品中腫瘤相關(guān)的遺傳畸變的百 分比濃度的增加可以表示疾病進(jìn)展或即將發(fā)生復(fù)發(fā)。類似地，在連續(xù)監(jiān)測期間樣品中腫瘤 相關(guān)的遺傳畸變的百分比濃度的減小可以表示治療反應(yīng)和/或緩解和/或良好預(yù)后。
[0083] III.測定基因組
[0084] 下文更詳細(xì)說明上文論述的各種基因組。舉例來說，論述參考基因組、組成型基因 組和樣品基因組。
[0085] A.參考基因組
[0086] 參考基因組（RG)是指受試者的或群體共有的單倍或二倍基因組。參考基因組是 已知的并且因此可以用以比較來自新患者的測序讀取?？梢詫碜曰颊叩臉悠返男蛄凶x取 與RG比對并且比較以鑒別讀取的變異。對于單倍基因組，每個(gè)基因座處僅存在一種核苷 酸，并且因此每個(gè)基因座可以視為半合子的。對于二倍基因組，可以鑒別雜合子基因座，這 種基因座具有兩種等位基因，其中任一等位基因可以允許與基因座的某一比對相匹配。 [0087] 參考基因組在受試者群體之中可以是相同的。此相同參考基因組可以用于健康受 試者以測定用于對患者分類（例如患有或不患有癌癥）的適當(dāng)閾值。然而，不同參考基因 組可以用于不同群體，例如用于不同種族或甚至用于不同家族。
[0088] B.組成基因組
[0089] 受試者（例如人或其它二倍生物體）的組成型基因組（CG)是指受試者的二倍基 因組。CG可以規(guī)定雜合性基因座，其中第一等位基因來自第一單倍型并且不同的第二等位 基因來自第二單倍型。注意，覆蓋該對雜合子基因座的兩種單倍型的結(jié)構(gòu)不需要已知，即哪 一個(gè)雜合子基因座上的等位基因與另一個(gè)雜合子基因座的等位基因是相同單倍型的結(jié)構(gòu) 即不需要已知。僅知道在每個(gè)雜合子基因座處存在兩種等位基因就足夠的。
[0090] CG可以由于多態(tài)性而不同于RG。舉例來說，RG上的基因座對于T可以是純合的， 但CG對于T/A是雜合的。因此，CG將在此基因座處展現(xiàn)變異。CG還可以由于遺傳的突變 (例如其在家族中蔓延）或新生突變（其出現(xiàn)于胎兒中，但其不存在于其父母中）而不同 于RG。遺傳的突變典型地稱為'種系突變'。一些所述突變與癌癥傾向性相關(guān)，例如在家族 中遺傳的BRCAl突變。所述突變不同于可以在人一生中由于細(xì)胞分裂而出現(xiàn)的'體細(xì)胞突 變'并且可以推動細(xì)胞和其子代即將變?yōu)榘┌Y。
[0091] 測定CG的目標(biāo)是從樣品基因組（SG)的突變中去除所述種系突變和新生突變以便 鑒別體細(xì)胞突變。SG中體細(xì)胞突變的量因此可以用以評估受試者中癌癥的可能性?？梢越?jīng) 進(jìn)一步對這些體細(xì)胞突變過濾以去除測序錯(cuò)誤，并且可能去除很少出現(xiàn)的體細(xì)胞突變（例 如展示變異體的僅一種讀?。?，因?yàn)檫@些該去除的所述體細(xì)胞突變不大可能與癌癥相關(guān)。
[0092] 在一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用細(xì)胞（白血球DNA)測定CG。然而，同樣還可以由無 細(xì)胞的DNA (例如血漿或血清）測定CG。對于其中大部分細(xì)胞是非惡性的樣品類型，例如來 自健康受試者的白血球，則大多數(shù)或一致性的基因組是CG。對于CG，每個(gè)基因組中的基因 座由所取樣的組織中的大部分細(xì)胞所具有的DNA序列組成。測序深度應(yīng)足以闡明組成型基 因組內(nèi)的雜合位點(diǎn)。
[0093] 作為另一個(gè)實(shí)例，血漿可以用作組成型樣品以測定CG。舉例來說，對于其中血漿中 的腫瘤DNA少于50 %并且S匪處于雜合子狀態(tài)的情況，例如突變是新增加的等位基因，則新 等位基因可以具有小于25%的濃度。然而，CG中SNP的雜合等位基因的濃度應(yīng)約為50%。 因此，可以在體細(xì)胞突變與CG的多態(tài)性之間加以區(qū)別。在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)使用血漿或 具有顯著腫瘤濃度的其它混合物時(shí)，可以在30-40%之間使用合適截止值加以區(qū)分體細(xì)胞 突變和多態(tài)性位點(diǎn)。腫瘤DNA濃度的測量可以適用于確保血漿中的腫瘤DNA少于50%。測 定腫瘤DNA濃度的實(shí)例描述于本文中。
[0094] C.樣品基因組
[0095] 樣品基因組（SG)不簡單地如同于RG和CG情況下的單倍或二倍基因組。SG是一 批來自樣品的讀取，并且可以包括：來自組成型DNA的對應(yīng)于CG的讀取、來自腫瘤DN