一種缺失sfp基因的生防菌及其發(fā)酵工藝和應(yīng)用
【專利說(shuō)明】-種缺失sfp基因的生防菌及其發(fā)酵工藝和應(yīng)用
[0001]
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明屬于微生物領(lǐng)域，具體涉及一種缺失S巧基因的生防菌及其發(fā)酵工藝和應(yīng) 用。
[0003]
【背景技術(shù)】
[0004] 芽抱桿菌是一類產(chǎn)生芽抱的革蘭氏陽(yáng)性菌株，它的分布廣泛，生理特征豐富，易于 分離和培養(yǎng)，是自然界中重要的微生物菌群，芽抱桿菌可W產(chǎn)生多種抗菌活性物質(zhì)，包括由 非核糖體途徑合成的非核糖體膚類抗生素W及由核糖體途徑合成的細(xì)菌素、酶類及其他活 性蛋白類抗菌物質(zhì)等。
[0005] 168菌株是芽抱桿菌的模式菌株，也是目前研究的最為透徹的菌株，他的全基因組 已于1997年測(cè)序完成。與野生芽抱桿菌不同的是模式菌株168由于在實(shí)驗(yàn)室的長(zhǎng)期繼代培 養(yǎng)，發(fā)生了很多的自發(fā)突變因而喪失了很多野生型的特點(diǎn)，比如S巧基因的自發(fā)突變，使得 168菌株喪失了產(chǎn)生脂膚類化合物的能力，因而缺失了抑菌的能力。S巧基因編碼的4'-磯 酸泛醜琉基己胺基轉(zhuǎn)移酶，是芽抱桿菌非核糖體途徑合成脂膚類化合物的關(guān)鍵基因。
[0006] 本研究的目標(biāo)菌株HAB-2經(jīng)過(guò)一系列的前期實(shí)驗(yàn)表明：該菌株沒(méi)有S巧基因，但是 通過(guò)現(xiàn)代的儀器分析手段我們又在HAB-2發(fā)酵液中檢測(cè)得到了由于S巧缺失而不可能得到 的脂膚類物質(zhì)一表面活性素類物質(zhì)，該就說(shuō)明本研究的生防菌HAB-2具有特殊的代謝脂 膚類的代謝途徑，值得進(jìn)一步的深入研究。
[0007]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種生防菌，其缺失S巧基因，但是具有產(chǎn)生脂膚類化 合物的能力，具有極高的研究?jī)r(jià)值。本發(fā)明的另一目的是提供該生防菌的發(fā)酵工藝。本發(fā) 明的再一個(gè)目的是提供該生防菌的發(fā)酵物活性成分的提取方法，本發(fā)明的最后一個(gè)目的是 提供該生防菌的應(yīng)用。
[0009] 本發(fā)明的第一個(gè)方面是提供一種缺失S巧基因的生防菌，為解淀粉芽抱桿菌 (公a聲扣7切"e/acie/?s)HAB-2,保藏編號(hào)為；CCTCC M 2015070。
[0010] 本發(fā)明第二個(gè)方面是提供本發(fā)明第一個(gè)方面所述的生防菌的發(fā)酵工藝，將本發(fā)明 第一個(gè)方面所述的生防菌接種于液體的溶菌肉湯培養(yǎng)基中，在26~3(TC的條件下，50~500 轉(zhuǎn)/分鐘搖菌1~3天，即得到發(fā)酵液。
[0011] 優(yōu)選地，還包括前處理步驟：先將本發(fā)明第一個(gè)方面所述的生防菌接種于溶菌肉 湯培養(yǎng)基上26~3(TC下活化培養(yǎng)1~6天。
[0012] 本發(fā)明的第H個(gè)方面是提供本發(fā)明第一個(gè)方面所述的生防菌的發(fā)酵物活性成分 的提取方法，包括w下步驟： 步驟1，采用本發(fā)明第二個(gè)方面所述的發(fā)酵工藝制得發(fā)酵液，然后離也除去菌體，得到 無(wú)菌發(fā)酵液； 步驟2,無(wú)菌發(fā)酵液用正下醇萃取，取萃取液，濃縮除去正下醇，即得。
[0013] 本發(fā)明的第四個(gè)方面是提供另一種本發(fā)明第一個(gè)方面所述的生防菌的發(fā)酵物活 性成分的提取方法，包括W下步驟： 包括W下步驟： a,采用本發(fā)明第二個(gè)方面所述的發(fā)酵工藝制得發(fā)酵液，然后離也除去菌體，得到無(wú)菌 發(fā)酵液； b，無(wú)菌發(fā)酵液用鹽酸調(diào)節(jié)抑至1. 5~3,1~1(TC下靜置至少化； C，離也，棄去上清液，取沉淀，即得。
[0014] 本發(fā)明的第五個(gè)方面是提供又一種本發(fā)明第一個(gè)方面所述的生防菌的發(fā)酵物活 性成分的提取方法，包括W下步驟；1)采用權(quán)利要求2~3任意一項(xiàng)所述的發(fā)酵工藝制得發(fā) 酵液，然后離也除去菌體，得到無(wú)菌發(fā)酵液； 2) 緩慢加入飽和硫酸饋，沉淀蛋白，1~1(TC下靜置至少化； 3) 離也得到沉淀，待沉淀干燥后用1/5~1/20原發(fā)酵液體積的、抑值為6~8的Tris-肥1 溶解沉淀，即得。
[0015] 本發(fā)明的第六個(gè)方面是提供本發(fā)明第一個(gè)方面所述的生防菌在制備脂膚類抑菌 制劑中的應(yīng)用。
[0016] 本發(fā)明的第走個(gè)方面是提供本發(fā)明第一個(gè)方面所述的生防菌在制備防治植物真 菌病害制劑中的應(yīng)用。
[0017] 其中，所述植物真菌病害為番茄早疫病、西瓜枯萎病、香蕉枯萎病、棉花枯萎病、橡 膠炭痘病、橡膠樹(shù)棒抱霉落葉病、茶輪斑病、芒果炭痘病、和或橡膠褐根病中的一種或多種。
[0018] 本發(fā)明提供的菌株，經(jīng)多項(xiàng)分類鑒定，確定為解淀粉芽抱桿菌的一個(gè)新種，暫命名 為解淀粉芽抱桿菌HAB-2(公HAB-2)，已于 2015 年 1 月 27 日 在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中也（CCTCC)進(jìn)行了菌種保藏，并證明存活，其保藏登記號(hào)為；CCTCC M 2015070,地址為武漢大學(xué)內(nèi)。
[0019] 本發(fā)明提供的解淀粉芽抱桿菌HAB-2缺失關(guān)鍵的脂膚類合成酶基因S巧基因，根 據(jù)現(xiàn)代分離技術(shù)與抑菌活性相結(jié)合的方法確定了該菌株產(chǎn)生的主要活性成分為表面活性 素類物質(zhì)，該就說(shuō)明該菌株具有特殊的與眾不同的生物合成途徑，具有極高的研究?jī)r(jià)值。本 發(fā)明提供的解淀粉芽抱桿菌HAB-2有很強(qiáng)的抑制病原真菌的能力，抑菌譜廣泛，能抑制多 種病原真菌，抑菌效果好，抑菌率高，該在W往研究中未見(jiàn)報(bào)道。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)該菌株的 發(fā)酵液經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單處理可W直接獲得有效成分，并且抑菌有效成分穩(wěn)定，可W在強(qiáng)酸性和強(qiáng) 堿性環(huán)境下均有很強(qiáng)的活性，活性不會(huì)受到影響，在紫外線照射24個(gè)小時(shí)抑菌活性不會(huì)改 變，高溫對(duì)抑菌有效成分依然沒(méi)有影響，并且本生防菌的發(fā)酵液對(duì)植物的生長(zhǎng)具有一定的 促進(jìn)生長(zhǎng)的作用。
[0020]
【附圖說(shuō)明】
[002。 圖1本發(fā)明的生防菌的功能基因的特異PCR檢測(cè)結(jié)果，其中，1 ;HAB-2菌株，A;:枯 草芽抱桿菌鑒定序列炬su-man)128化p，B ;地衣芽抱桿菌鑒定序列炬li-man) 1278bp，C ;解 淀粉芽抱桿菌鑒定序列炬am-man) 127化P, M ;200化P Marker。
[002引圖2為本發(fā)明的生防菌在不同培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)，其中，A ;AYBA培養(yǎng)基，B ;BPY 培養(yǎng)基，C ;LB培養(yǎng)基，D ;NA培養(yǎng)基，E ;基礎(chǔ)培養(yǎng)基，F(xiàn) ;發(fā)酵培養(yǎng)基。
[0023] 圖3為菌株HAB-2和168菌株抗生素合成相關(guān)基因PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖， 其中，A ;i1:uC，B ;srfAB，C ;fenD, D M ;2000DNA marker。
[0024] 圖4為菌株HAB-2與芽抱桿菌模式菌株168脂膚類關(guān)鍵合成酶基因的PCR產(chǎn) 物瓊脂糖凝膠電泳圖，其中，M ;2000Marker，A ;HAB-2-ituA基因，B : B. S168-ituA基因， C ;HAB-2-ituD 基因，D 化 S168-ituD 基因，E ;HAB-2-lpal4 基因，F(xiàn) 化 S168-lpal4 基因， G ;HAB-2-sfp 基因，H 化 S168-sfp 基因，I ;HAB-2-mycB 基因，J ;B. S 168-mycB 基因，K : HAB-2-fenB 基因，L : B. S168-fenB 基因。
[00巧]圖5為菌株HAB-2與B. S168菌株抑菌試驗(yàn)結(jié)果。
[0026] 圖6為HAB-2的抑菌物質(zhì)的抑菌活性檢測(cè)結(jié)果，其中，A為正下醇過(guò)凝膠測(cè)活結(jié) 果；1正下醇（23. 08mm)，2正下醇凝膠測(cè)試有活性2號(hào)（12. 12mm)，3凝膠測(cè)試有活性3 號(hào)（15. 78mm) ;B為正下醇抽柱測(cè)活結(jié)果；4抽柱有活性甲醇沖柱，5抽柱氯仿甲醇1 : 1 ; C為正下醇抽柱測(cè)活結(jié)果：抽柱其他觸分無(wú)活性；D為脂膚類凝膠柱測(cè)活結(jié)果；6脂膚類 (14. 77mm)，7 脂膚類有活性 2 號(hào)（11. 09mm)。
[0027] 圖7為HAB-2的抑菌物質(zhì)的T化檢測(cè)結(jié)果，框部分為有活性的部分，其中，1正下 醇，2正下醇凝膠測(cè)試有活性2號(hào)，3凝膠測(cè)試有活性3號(hào)，4抽柱有活性甲醇沖柱，5抽柱氯 仿甲醇1 : 1，6脂膚類，7脂膚類有活性2號(hào)。
[0028] 圖8為本發(fā)明的生防菌的對(duì)部分植物病原真菌的抑菌試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果的照片，其中， ^ :儀?傲嵌檀病 iColletotrichum gloeosporioides), & ?.苦男速i 檀病 \ 號(hào) iColletotrichum /fe/7z)，C ;橡膠樹(shù)棒抱霉落葉?。ǚ虑駉ra ca5W'ic(97a)，D ;香蕉枯萎 病 1 號(hào)小種（戶"占ari"曲曲 f. sp. cubense, F0C)。
[0029] 圖9為本發(fā)明的生防菌產(chǎn)生的有效成分的穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果圖，其中A為25C的發(fā) 酵液；2正下醇提取物，4脂膚類沉淀物，5硫酸饋沉淀物；B為28C的發(fā)酵液；10正下醇提 取物，12脂膚類沉淀物，15硫酸饋沉淀物。
[0030] 圖10為發(fā)明的生防菌產(chǎn)生的有效成分的抑、紫外線穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果，其中，1為正 下醇提取物原樣，2-12分別為正下醇提取物抑=2-12, 36為脂膚類沉淀物原樣，13-23分別 為脂膚類沉淀物PH=2-12, 25為硫酸饋沉淀物原樣，26-36分別為硫酸饋沉淀物PH=2-12,42 為正下醇原樣，37-41分別為紫外照射3、6、9、12、2化，43脂膚原樣，44-48分別為紫外照射 3、6、9、12、2化，49為硫酸饋沉淀原樣，50-54分別為紫外照射3、6、9、12、2化。
[0031]
【具體實(shí)施方式】
[0032] 下面參照附圖，結(jié)合具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說(shuō)明，W更好地理解本發(fā) 明。
[0033] 一、菌種鑒定和形態(tài)學(xué)特征 本發(fā)明所使用的生防菌株是從棉花根際±壤中分離篩選得到的。通過(guò)已知的基因組序 列有針對(duì)性的設(shè)計(jì)特異引物，利用交叉引物相互印證的方法，根據(jù)特異引物與常規(guī)形態(tài)學(xué) 鑒定的相互印證，逐步的從芽抱桿菌屬鑒定到具體的種，經(jīng)過(guò)研究發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的生防菌為 解淀粉芽抱桿菌HAB-2,其PCR檢測(cè)結(jié)果如圖