1所示。
[0034] 本發(fā)明的解淀粉芽抱桿菌HAB-2的菌落形態(tài)如圖2所示，其中， A ;在AYDA培養(yǎng)基上解淀粉芽抱桿菌HAB-2的菌落形態(tài)不規(guī)則，菌落大且平坦，容易從 培養(yǎng)基上挑取，菌落干燥，呈淺蹤色； B;在BPY培養(yǎng)基上解淀粉芽抱桿菌HAB-2菌落呈圓形，菌落外圍有權(quán)皺，容易從培養(yǎng)基 上挑取，菌落干燥，呈淺蹤色； C ;在LB培養(yǎng)上培養(yǎng)的解淀粉芽抱桿菌HAB-2菌落形態(tài)不規(guī)則，菌落小，外圍有小的權(quán) 皺，容易從培養(yǎng)基上挑取，菌落干燥，呈乳白色； D ;在NA培養(yǎng)基上培養(yǎng)的解淀粉芽抱桿菌HAB-2和前面H個(gè)差異性較大，菌落不規(guī)則， 菌落濕潤，呈油狀，為米黃色； E ;在基礎(chǔ)培養(yǎng)基的解淀粉芽抱桿菌HAB-2菌落不規(guī)則，較干燥，呈米黃色； F ;在發(fā)酵培養(yǎng)基上解淀粉芽抱桿菌HAB-2菌落很小，不規(guī)則，容易從培養(yǎng)基上挑取，菌 落較干燥，呈白色。
[00巧]二、脂膚類合成關(guān)鍵酶基因的序列分析 表面活性素家族代謝過程關(guān)鍵酶S巧基因(枯草芽抱桿菌磯酸泛醜琉基己胺轉(zhuǎn)移酶)， 缺失該酶則可能導(dǎo)致芽抱桿菌不能產(chǎn)生表面活性素類物質(zhì)，模式菌株B. S168通過全基因 組分析發(fā)現(xiàn)該菌株僅僅是S巧基因不完整就導(dǎo)致該菌株喪失了抑菌能力。通過實(shí)驗(yàn)表明本 菌株HAB-2沒有S巧基因，但是本實(shí)驗(yàn)又通過現(xiàn)代波普技術(shù)飛行時(shí)間質(zhì)譜，測試脂膚類提取 物的成分，發(fā)現(xiàn)有表面活性素類物質(zhì)的存在，該就說明本菌株具有新的與眾不同的代謝表 面活性素類物質(zhì)的代謝途徑。
[0036] 2. 1HAB-2與芽抱桿菌模式菌株168脂膚類基因的序列檢測 實(shí)驗(yàn)挑選出4對有代表性的脂膚類基因（分別代表伊枯草菌素Iturin，表面活性素 Su計(jì)actin、豐原素化ngycin)序列進(jìn)行PCR，結(jié)果如圖3所示，表明：從HAB-2菌株可WPCR 擴(kuò)增得到srfAB、fenD、ituB H個(gè)基因，但是168菌株擴(kuò)增僅可W擴(kuò)增得到fenD。
[0037] 2. 2HAB-2與芽抱桿菌模式菌株168脂膚類關(guān)鍵合成酶基因的序列檢測 實(shí)驗(yàn)挑選出6對有代表性的脂膚類合成過程中的關(guān)鍵合成酶基因基因（分別代表伊枯 草菌素Iturin，表面活性素Su計(jì)actin、豐原素化ngycin)序列進(jìn)行PCR，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4 所不，結(jié)果表明；HAB-2困株可W PCR得到關(guān)鍵酶基因；ituA基因、lpal4基因、mycB基因、 fenB基因。模式菌株B. S168菌株可WPCR得到；sfp基因。
[0038] 2. 3 HAB-2與B. S168菌株抑菌試驗(yàn) 將芒果炭痘病病原真菌接種于9cm的PDA培養(yǎng)平板上。在距離中央2.5 cm的位置等 距離接種HAB-2和B. S168菌株，將培養(yǎng)皿倒置，放于28C下暗培養(yǎng)至整個(gè)培養(yǎng)皿的2/3 時(shí)，進(jìn)行觀察抑菌情況。結(jié)果如圖5所示。由于S巧基因的不完整導(dǎo)致B.S168菌株不能產(chǎn) 生脂膚類物質(zhì)因此沒有抑菌活性，而本實(shí)驗(yàn)菌株HAB-2缺失該基因但仍有抑菌活性。
[0039] 2.4薄層層析與活性成分的確定 濾紙片側(cè)活法：將芒果炭痘病菌餅接種在100ml PDA液體培養(yǎng)基中，28C，180 rpm培 養(yǎng)3-5d，用4層滅菌紗布過濾掉菌絲就可得到芒果炭痘菌抱子息浮液，將PDA固體培養(yǎng)基加 熱溶解，待培養(yǎng)基冷卻至約45C時(shí)，按培養(yǎng)基：抱子息浮液=6 : 1的比例將芒果炭痘菌抱 子息浮液加入到PDA培養(yǎng)基中，邊加邊混勻，倒平板即為芒果炭痘菌抱子息浮液平板，取樣 品15 y以滴加在6mm的滅菌濾紙片上等濾紙片上的樣品徹底干燥W后，均勻的貼在抱子息 浮液平板上，用來檢測HAB-2的抑菌物質(zhì)的抑菌活性。結(jié)果如圖6所示。
[0040] 通過TLC薄層層析與抑菌成分相互對照的方法，我們成功的找出了 HAB-2菌株發(fā) 酵液中有活性的部分W及一些相關(guān)的特性，確定有活性的部分為脂膚類物質(zhì)，并且該類物 質(zhì)極性較大，結(jié)果如圖7所示。 2. 5飛行時(shí)間質(zhì)譜 對HAB-2正下醇提取物進(jìn)行飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測，根據(jù)飛行時(shí)間質(zhì)譜測試得到分子 量的結(jié)果進(jìn)行比對我們可知并且可W產(chǎn)出脂膚列物質(zhì)有：C13-I化rinA、C15-IturinB、 C14-Mycosubtilin、C14-BacillomycinD、C15-BacillomycinD、C16-BacillomycinD, C 15-SurfactinA、C14-SurfactinC、C-16FengycinA、C17-FengycinA、C16-FengycinB、 C17-FengycinB。測試的結(jié)果證明HAB-2正下醇提取物中檢測到了表面活性素類脂膚物質(zhì)。
[0041] H、活性成分提取方法 正下醇萃取法： 將保存的生防菌菌株A178接種于溶菌肉湯培養(yǎng)基上28C活化培養(yǎng)，培養(yǎng)3天，挑去黃 豆粒大小的生防菌A178加入到液體的溶菌肉湯培養(yǎng)基中，28C，200轉(zhuǎn)每分鐘搖菌2天，即 得到發(fā)酵液，利用高速離也機(jī)，10000轉(zhuǎn)每分鐘離也10分鐘去除菌體，得到無菌體發(fā)酵液， 按照1:1發(fā)酵液與正下醇的比例加入正下醇，是兩種溶液充分混合，靜止12個(gè)小時(shí)，分液漏 斗萃取得到上層正下醇，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，蒸出有機(jī)溶劑正下醇即得到有效成分。
[0042] 酸沉淀法(脂膚類沉淀法）； 同正下醇萃取法得到無菌體發(fā)酵液，在該發(fā)酵液中用6摩爾每升的鹽酸滴定，調(diào)節(jié)PH 值，使PH值調(diào)節(jié)到2停止滴加鹽酸，封口放入4°C冰箱冷藏過夜（12小時(shí))，再利用高速離也 機(jī)4C，11000轉(zhuǎn)每分鐘，離也10分鐘，棄去上清液，得到沉淀，經(jīng)檢測沉淀即是脂膚類化合 物(有效成分)。
[0043] 硫酸饋飽和沉淀法： 同正下醇萃取法得到無菌體發(fā)酵液，緩慢加入飽和硫酸饋，沉淀蛋白，4C靜置過夜，離 也得到沉淀，待沉淀干燥后用1/10原發(fā)酵液體積的、抑值為6. 8的Tris-HCl溶解沉淀，即 得到粗蛋白。
[0044] 四、抑菌試驗(yàn) 采用平皿對時(shí)法于PDA培養(yǎng)基平板上檢測HAB-2菌體抑菌譜，發(fā)現(xiàn)其對所有供試植物 病原真菌的生長具有抑制作用。在PDA培養(yǎng)基上用平皿擴(kuò)散法測得抑菌譜和抑制能力結(jié)果 如表1和圖8所示。生防菌HAB-2對橡膠褐根?。ɑ痚Wi/7化 /7(〇ri化 (Corner) G.H.化nn.) 抑菌率最好，抑菌率達(dá)到66. 91%，對茶輪斑病菌（化別?卵部inii)抑菌效果最 差，抑菌率為38. 76%。對熱帶植物病原菌抑菌率都可W達(dá)到50-60%，有較好的抑菌效果。
[0045] 表1 HAB-2菌體抑菌譜和抑制能力
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種缺失Sfp基因的生防菌，其特征在于，為解淀粉芽孢桿菌（ 卯e/aciefldHABJ，保藏編號為：CCTCC M 2015070。
2. -種權(quán)利要求1所述的生防菌的發(fā)酵工藝，其特征在于，將權(quán)利要求1所述的生防菌 接種于液體的溶菌肉湯培養(yǎng)基中，在26~30°C的條件下，50~500轉(zhuǎn)/分鐘搖菌1~3天，即得 到發(fā)酵液。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的發(fā)酵工藝，其特征在于，還包括前處理步驟：先將權(quán)利要求1 所述的生防菌接種于溶菌肉湯培養(yǎng)基上26~30°C下活化培養(yǎng)1~6天。
4. 一種如權(quán)利要求1所述的生防菌的發(fā)酵物活性成分的提取方法，其特征在于，包括 以下步驟： 步驟1，采用權(quán)利要求2~3任意一項(xiàng)所述的發(fā)酵工藝制得發(fā)酵液，然后離心除去菌體， 得到無菌發(fā)酵液； 步驟2,無菌發(fā)酵液用正丁醇萃取，取萃取液，濃縮除去正丁醇，即得。
5. -種權(quán)利要求1所述的生防菌的發(fā)酵物活性成分的提取方法，其特征在于，包括以 下步驟： a，采用權(quán)利要求2~3任意一項(xiàng)所述的發(fā)酵工藝制得發(fā)酵液，然后離心除去菌體，得到 無菌發(fā)酵液； b，無菌發(fā)酵液用鹽酸調(diào)節(jié)pH值至1. 5~3,1~10°C下靜置至少3h ; c，離心，棄去上清液，取沉淀，即得。
6. -種權(quán)利要求1所述的生防菌的發(fā)酵物活性成分的提取方法，其特征在于，包括以 下步驟： 1) 采用權(quán)利要求2~3任意一項(xiàng)所述的發(fā)酵工藝制得發(fā)酵液，然后離心除去菌體，得到 無菌發(fā)酵液； 2) 緩慢加入飽和硫酸銨，沉淀蛋白，1~10°C下靜置至少3h ; 3) 離心得到沉淀，待沉淀干燥后用1/5~1/20原發(fā)酵液體積的、pH值為6~8的Tris-HCl 溶解沉淀，即得。
7. 權(quán)利要求1所述的生防菌在制備脂肽類抑菌制劑中的應(yīng)用。
8. 權(quán)利要求1所述的生防菌在制備防治植物真菌病害制劑中的應(yīng)用。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述植物真菌病害為番茄早疫病、西瓜枯 萎病、香蕉枯萎病、棉花枯萎病、橡膠炭疽病、橡膠樹棒孢霉落葉病、茶輪斑病、芒果炭疽病、 和/或橡膠褐根病中的一種或多種。
【專利摘要】本發(fā)明提供的解淀粉芽孢桿菌HAB-2，保藏編號為CCTCC M 2015070。其缺失關(guān)鍵的脂肽類合成酶基因sfp基因，但仍能產(chǎn)生表面活性素類物質(zhì)，這就說明該菌株具有特殊的與眾不同的生物合成途徑，具有極高的研究價(jià)值。該解淀粉芽孢桿菌HAB-2有很強(qiáng)的抑制病原真菌的能力，抑菌譜廣泛，能抑制多種病原真菌，抑菌效果好，抑菌率高。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)該菌株的發(fā)酵液經(jīng)過簡單處理可以直接獲得有效成分，并且抑菌有效成分穩(wěn)定，可以在強(qiáng)酸性和強(qiáng)堿性環(huán)境下均有很強(qiáng)的活性，在紫外線照射24個(gè)小時(shí)抑菌活性不會改變，高溫對抑菌有效成分沒有影響，并且本生防菌的發(fā)酵液對植物的生長具有一定的促進(jìn)生長的作用。CCTCC NO:M201507020150127
【IPC分類】C12R1-07, A01N63-02, C12P21-00, A01P3-00, C12N1-20
【公開號】CN104673716
【申請?zhí)枴緾N201510061973
【發(fā)明人】繆衛(wèi)國, 靳鵬飛, 劉文波, 鄭服叢, 王皓楠
【申請人】海南大學(xué)
【公開日】2015年6月3日
【申請日】2015年2月6日