用于對(duì)來(lái)自體液的循環(huán)上皮腫瘤細(xì)胞亞群體進(jìn)行培養(yǎng)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及用于對(duì)來(lái)自人或動(dòng)物體液的循環(huán)上皮腫瘤細(xì)胞亞群體進(jìn)行培養(yǎng)的方 法。所述動(dòng)物可以是哺乳動(dòng)物。
【背景技術(shù)】
[0002] Dontu，G?等，Genes&Development 17, 2003,第 1253-1270 頁(yè)公開了對(duì)來(lái)自乳房組 織的人上皮細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)的方法。通過(guò)將乳房組織機(jī)械解離或酶解離制備人乳腺上皮 細(xì)胞的單細(xì)胞懸液，并在不允許貼附至基底的條件下培養(yǎng)所述懸液而生成所述細(xì)胞。在該 方法中，僅有少量細(xì)胞群體在懸液中增殖，所述細(xì)胞被稱為乳腺球（mammospheres)。
[0003] Lu，J?等，Int.J. Cancer 126, 2010,第 669-683 頁(yè)公開了首先借助 Ficoll 密度 梯度離心富集來(lái)自乳腺癌患者外周血的細(xì)胞，將由此獲得的單核細(xì)胞接種于膠原貼附基質(zhì) 上，并在0)2細(xì)胞培養(yǎng)箱中在細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)中將它們孵育12小時(shí)。僅對(duì)能夠在該時(shí)間內(nèi)貼 附的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)的進(jìn)一步培養(yǎng)，而將非貼附細(xì)胞和舊培養(yǎng)介質(zhì)去除。通過(guò)加入新鮮細(xì)胞 培養(yǎng)介質(zhì)對(duì)貼附細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，隨后每3天更換新鮮細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)。在該程序中，培養(yǎng)物中 細(xì)胞的數(shù)量和大小隨時(shí)間增加。20天后，出現(xiàn)具有上皮形態(tài)的廣泛鋪展的細(xì)胞。
[0004] DE 10 2009 047 146 A1公開了用于預(yù)測(cè)患者中的實(shí)體上皮腫瘤誘導(dǎo)的腫瘤疾病 對(duì)治療措施（therapeutic measure)的應(yīng)答的方法。在該方法中，將來(lái)自患者體液的各上 皮腫瘤細(xì)胞收集至細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)中。所述細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)優(yōu)選不含加入的生長(zhǎng)因子并且不含 加入的含有生長(zhǎng)因子的血清。將來(lái)自含有腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)樣品中的腫瘤細(xì)胞暴露 于所述治療措施，而不對(duì)來(lái)自含有腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)的等同對(duì)照樣品中的腫瘤細(xì)胞 進(jìn)行處理。隨后，對(duì)于樣品和對(duì)照樣品，均確定瀕死上皮腫瘤細(xì)胞和死亡上皮腫瘤細(xì)胞相對(duì) 于上皮腫瘤細(xì)胞總數(shù)的比例，由此，將上皮腫瘤細(xì)胞與治療措施相關(guān)的死亡率作為所述應(yīng) 答的量度。在所述治療措施與確定瀕死上皮腫瘤細(xì)胞和死亡上皮腫瘤細(xì)胞相對(duì)于上皮腫瘤 細(xì)胞總數(shù)的比例之間可存在數(shù)小時(shí)至數(shù)天的時(shí)間段。在該時(shí)間段內(nèi)，將腫瘤細(xì)胞維持在慣 用的細(xì)胞培養(yǎng)條件下，這允許腫瘤細(xì)胞在無(wú)治療措施的情況下在細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)中存活。并 未公開腫瘤細(xì)胞在這些條件下增殖。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供用于對(duì)來(lái)自患者體液的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)的替代方法，所 述患者罹患由上皮腫瘤導(dǎo)致的腫瘤疾病。所培養(yǎng)的細(xì)胞將能夠表征該腫瘤疾病。此外，還 提供了利用所述方法所培養(yǎng)的細(xì)胞的用途以及所述腫瘤細(xì)胞的治療用途。
[0006] 該目的由權(quán)利要求1、8和13的特征實(shí)現(xiàn)。有用的實(shí)施方式由權(quán)利要求2-7和9-12 的特征披露。
[0007] 本發(fā)明提供了用于對(duì)來(lái)自體液的循環(huán)上皮腫瘤細(xì)胞亞群體進(jìn)行培養(yǎng)的方法，所述 體液來(lái)自罹患（affected by)上皮腫瘤的人或動(dòng)物，更具體而言為哺乳動(dòng)物。在所述方法 中，將存在于體液中且包含至少一個(gè)細(xì)胞核的各細(xì)胞從所述體液中分離，并懸?。?，避免 細(xì)胞貼附至基底）培養(yǎng)至少24小時(shí)，更具體而言至少2天，更具體而言至少3天，更具體而 言至少4天，更具體而言至少5天，更具體而言至少6天，更具體而言至少7天，從而形成球 狀體（spheroids)。在培養(yǎng)以形成球狀體時(shí)，至少將細(xì)胞培養(yǎng)至通過(guò)增殖形成球狀體（任選 地添加至少一種生長(zhǎng)因子）。此處，將上皮腫瘤細(xì)胞理解為特別意指具有上皮細(xì)胞粘附分 子（EpCAM，CD326)或相應(yīng)的動(dòng)物性分子的腫瘤細(xì)胞。在該上下文中，所述細(xì)胞可以是例如 癌（carcinoma)細(xì)胞或肉瘤細(xì)胞。
[0008] 不含細(xì)胞核的細(xì)胞一般為可能存在于體液中的紅細(xì)胞。這些紅細(xì)胞還可存在于已 分離的細(xì)胞中。如果體液中存在完整的紅細(xì)胞，可將包含至少一個(gè)細(xì)胞核的各細(xì)胞與完整 的紅細(xì)胞分離，更具體而言通過(guò)裂解所述完整的紅細(xì)胞來(lái)進(jìn)行所述分離。與完整紅細(xì)胞的 分離可在將包含至少一個(gè)細(xì)胞核的各細(xì)胞從體液分離之前、之中或之后進(jìn)行。
[0009] 懸浮培養(yǎng)是在不允許貼附至基底的條件下進(jìn)行的培養(yǎng)程序?？赏ㄟ^(guò)不使用包被有 膠原或以一些其它方式促進(jìn)細(xì)胞貼附的細(xì)胞培養(yǎng)器皿進(jìn)行培養(yǎng)，和/或定期或不斷地將含 有腫瘤細(xì)胞的懸液移出，來(lái)實(shí)現(xiàn)所述懸浮培養(yǎng)。促進(jìn)細(xì)胞貼附的細(xì)胞培養(yǎng)器皿可以例如由 具有表面電荷的塑料構(gòu)成。當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)器皿為包被有硅酮或硅烷的細(xì)胞培養(yǎng)器皿時(shí)，也可 避免細(xì)胞貼附。
[0010] 與從LU等知曉的培養(yǎng)程序不同，懸浮培養(yǎng)在不需要為增殖而貼附于表面的情況 下誘導(dǎo)或允許體液中存在的循環(huán)上皮腫瘤細(xì)胞亞群體增殖。
[0011] 根據(jù)Lu，J.等第671頁(yè)右欄第2段，12小時(shí)后去除非貼附細(xì)胞，由此不繼續(xù)培養(yǎng) 非貼附細(xì)胞。因此，在細(xì)胞培養(yǎng)器皿的包被表面上培養(yǎng)特異性貼附于表面生長(zhǎng)的循環(huán)上皮 腫瘤細(xì)胞，并利用貼附于所述表面進(jìn)行選擇。然而，本方法的發(fā)明人認(rèn)識(shí)到，循環(huán)上皮腫瘤 細(xì)胞不僅包含貼附生長(zhǎng)的細(xì)胞，還包含可不貼附地?zé)o性增殖的細(xì)胞。進(jìn)而，發(fā)明人認(rèn)識(shí)到， 對(duì)這些非貼附生長(zhǎng)的細(xì)胞進(jìn)行特定培養(yǎng)形成細(xì)胞克隆，所述細(xì)胞克隆中的細(xì)胞具有腫瘤疾 病的特征，因此即便在去除引發(fā)腫瘤疾病的原發(fā)瘤后，也允許對(duì)腫瘤疾病進(jìn)行很好的表征。 所述腫瘤疾病可為乳腺癌、前列腺癌、肺癌、腎癌、肝癌、胰腺癌或結(jié)腸癌。
[0012] 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，特別是當(dāng)尚未形成可檢測(cè)的轉(zhuǎn)移灶（metastases)時(shí)，總循環(huán)腫瘤細(xì)胞 對(duì)于監(jiān)測(cè)抗腫瘤治療具有重要的臨床顯著性。循環(huán)腫瘤細(xì)胞對(duì)治療的應(yīng)答與無(wú)復(fù)發(fā)存活 (relapse-free survival)極其相關(guān)。大量腫瘤細(xì)胞從上皮腫瘤的腫瘤組織釋放入血流，然 而，其中僅部分能夠在次級(jí)組織（secondary tissue)中形成轉(zhuǎn)移灶。
[0013] 本發(fā)明方法的發(fā)明人已進(jìn)一步認(rèn)識(shí)到，能夠不貼附而增殖的循環(huán)腫瘤細(xì)胞亞群體 是所謂的腫瘤干細(xì)胞或腫瘤起始細(xì)胞（tumor-initiating cells)。發(fā)明人還認(rèn)識(shí)到，所述 細(xì)胞以球狀體的形式生長(zhǎng)，即能夠在增殖中形成球狀三維結(jié)構(gòu)。上皮腫瘤細(xì)胞的懸浮培養(yǎng) 允許所述球狀體的形成，作為結(jié)果，允許對(duì)循環(huán)腫瘤細(xì)胞群體中作為亞群體的腫瘤干細(xì)胞 的存在進(jìn)行檢測(cè)。在所述球狀體中，所述干細(xì)胞形成不同分化階段的祖細(xì)胞。"循環(huán)上皮腫 瘤細(xì)胞包含能夠以球狀體形式培養(yǎng)的腫瘤干細(xì)胞"這一點(diǎn)是之前未知的。推測(cè)所述腫瘤干 細(xì)胞對(duì)轉(zhuǎn)移而言極為重要。
[0014] 所述體液可為淋巴液或血液，更具體而言可為外周血。外周血的有利之處在于其 良好的可得性（accessibility)和即用性（ready availability) 〇
[0015] 在本方法的一個(gè)實(shí)施方式中，將存在于體液中且包含至少一個(gè)細(xì)胞核的各細(xì)胞 從體液中分離，而不對(duì)這些細(xì)胞中的特定細(xì)胞進(jìn)行選擇，將分離的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)介 質(zhì)，并在細(xì)胞培養(yǎng)條件下維持在細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)中。在該上下文中，所述細(xì)胞培養(yǎng)條件一 般指適于培養(yǎng)上皮細(xì)胞的條件。所述細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)一般包含在培養(yǎng)介質(zhì)（如，例如RPMI 1640、杜氏改良 Eagle's 介質(zhì)（Dulbecco' s Modified Eagle' s Medium，DMEM)、或 DMEM 與 RPMI 1640的混合）中的動(dòng)物血清（如，例如胎牛血清）、L-谷氨酰胺、生長(zhǎng)刺激物質(zhì)（如， 例如胰島素）、氫化可的松和生長(zhǎng)因子（如，例如EGF)。所述細(xì)胞培養(yǎng)條件一般包括：在 35. 5°C -37. 5°C范圍內(nèi)的溫度、更具體而言在36.8°C -37. 1°C范圍內(nèi)的溫度、更具體而言 37 °C的溫度；以及包含4. 5 % -5. 5 % C02的氣氛（atmosphere)、更具體而言包含5 % 0)2的 氣氛。適于上皮細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)條件和適于上皮細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)為哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng) 領(lǐng)域技術(shù)人員所知曉，例如從Lu等知曉。根據(jù)具體腫瘤細(xì)胞進(jìn)行的任何必要調(diào)整（例如選 擇基礎(chǔ)培養(yǎng)介質(zhì)或胎牛血清比例）在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)，不需要任何過(guò)度的實(shí) 驗(yàn)負(fù)擔(dān)。
[0016] 雖然不對(duì)特定細(xì)胞進(jìn)行選擇而對(duì)從體液中分離的細(xì)胞進(jìn)行懸浮培養(yǎng)導(dǎo)致待轉(zhuǎn)移 至細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)中的不同細(xì)胞（例如包括白細(xì)胞）的多元化，僅有能夠懸浮增殖的細(xì)胞增 殖。在這方面