，所述培養(yǎng)引起的正是這些細胞的特異性擴增。從體液分離細胞而不對特定 細胞進行選擇避免了丟失能夠懸浮增殖的細胞，所述細胞通常僅構(gòu)成循環(huán)上皮腫瘤細胞的 一小部分。
[0017] 可多次（1印eatedly)或定期地（例如每5天）將新鮮細胞培養(yǎng)介質(zhì)加入至細胞 培養(yǎng)介質(zhì)。或者，可多次或定期地將細胞轉(zhuǎn)移至新鮮細胞培養(yǎng)介質(zhì)。為這一目的，可小心地 (即，以較低的轉(zhuǎn)速）將細胞離心，并在新鮮細胞培養(yǎng)介質(zhì)中重懸。
[0018] 在本方法的一個實施方式中，將在培養(yǎng)中已形成球狀體的腫瘤細胞從所培養(yǎng)的腫 瘤細胞中分離，特別地用于進一步培養(yǎng)、分析或測試其對治療措施的敏感性。在下文中，由 腫瘤細胞形成的球狀體也稱為腫瘤球狀體。由于與單細胞相比腫瘤球狀體具有較大的尺 寸，例如可通過低轉(zhuǎn)速離心、或通過沉降、或通過在顯微鏡觀察下將腫瘤球狀體吸入毛細管 來容易地實現(xiàn)分離。
[0019] 本發(fā)明進一步提供了根據(jù)本發(fā)明進行培養(yǎng)并存在于球狀體中的腫瘤細胞在如下 方面的用途：檢查球狀體中存在的腫瘤細胞的自我更新（self-renewal)能力和/或球狀體 中產(chǎn)生的祖細胞的自我更新能力；和/或測試球狀體中的腫瘤細胞對用于治療在人或動物 (更具體而言為哺乳動物）中由循環(huán)上皮腫瘤細胞的產(chǎn)生而引起的腫瘤疾病的藥劑或治療 措施的敏感性。發(fā)明人認識到，通過構(gòu)成轉(zhuǎn)移灶形成的基礎(chǔ)，存在于球狀體中的腫瘤細胞相 當(dāng)于在人或動物中維持腫瘤生長進行的細胞，即使在實體上皮原發(fā)腫瘤被完全切除后也是 如此。因此，這些腫瘤細胞使得能夠非常好地對腫瘤疾病進行表征。球狀體中出現(xiàn)的自我 更新能力以及產(chǎn)生祖細胞也為腫瘤干細胞的特別表征。對形成球狀體的細胞對用于治療在 人或動物中由循環(huán)上皮腫瘤細胞的產(chǎn)生而引起的腫瘤疾病的藥劑或治療措施的敏感性的 測試允許對所述藥劑或治療措施在預(yù)防腫瘤疾病中轉(zhuǎn)移灶形成的效力方面進行良好的、全 新類型的預(yù)測。
[0020] 所述治療措施可為物理措施，所述物理措施更具體而言為輻射處理或過熱處理 (hyperthermia treatment);或者，所述治療措施可為藥物措施，所述藥物措施更具體而言 為化療、激素治療或抗體治療。此外，還可對新型藥劑和已知藥劑對腫瘤球狀體的效力進行 測試。
[0021] 可使用針對人上皮抗原EpCAM (上皮細胞粘附分子）的抗體對存在于球狀體中的 腫瘤細胞進行熒光標(biāo)記，隨后使用圖像分析方法（例如使用激光照射）進行分析。為該目 的，無需使腫瘤細胞單個化（singularize)?？贵w允許對作為上皮細胞的細胞進行表征。此 外，可用能夠被熒光檢測、且特異或優(yōu)先對死細胞進行染色的物質(zhì)（更具體而言為碘化丙 啶）對存在于球狀體中的腫瘤細胞進行染色。這允許對例如經(jīng)常出現(xiàn)在球狀體內(nèi)部的死細 胞進行識別。為進行圖像分析，例如可使用激光掃描細胞計量儀或熒光顯微鏡（更具體而 言使用帶有圖像獲取元件/照相機和分析軟件的熒光顯微鏡，如，例如Olympus SCANK篩選 工作站）。
[0022] 在該用途的一個實施方式中，標(biāo)記、測定和/或染色在Ca2+螯合劑存在的情況 下進行，所述Ca 2+螯合劑更具體而言為EDTA或EGTA。Ca 2+螯合劑能夠防止球狀體凝聚 (clumping)〇
[0023] 本發(fā)明進一步提供了用于在人或動物（更具體而言為哺乳動物）中對腫瘤疾病 進行免疫治療的根據(jù)本發(fā)明所述方法培養(yǎng)的形成球狀體的腫瘤細胞。為這一目的，可通 過例如輻射來殺死存在于球狀體中的腫瘤細胞或至少將存在于球狀體中的腫瘤細胞處理 為不再能增殖。隨后，可將所述腫瘤細胞懸浮在佐劑（adjuvant)中，并隨后例如皮下給 予人或動物。這觸發(fā)人或動物中針對以球狀體形式生長的腫瘤細胞的抗體的形成。由 此形成的抗體隨后還可攻擊人或動物中的其它腫瘤細胞，并因此有助于腫瘤消退（tumor regression)〇
【附圖說明】
[0024] 現(xiàn)基于示例性實施方式和附圖更具體地描述本發(fā)明。所示出的是：
[0025] 圖la、b、c :培養(yǎng)7天（圖la)、14天（圖lb)以及21天（圖lc)后的腫瘤細胞的 球狀體，所述腫瘤細胞來自罹患結(jié)腸癌的患者的外周血；以及
[0026] 圖2 :用抗體和碘化丙啶進行熒光染色的腫瘤球狀體的熒光顯微圖。
【具體實施方式】
[0027] 使用如下化學(xué)品、試劑、緩沖液、溶液、抗體、儀器和耗材以及所指明的介質(zhì)實施如 下所述的方法：
[0028] 化學(xué)品和試劑
[0029]
【主權(quán)項】
1. 一種用于對來自體液的循環(huán)上皮腫瘤細胞亞群體進行培養(yǎng)的方法，所述體液來自罹 患上皮腫瘤的人或動物，其中，將存在于所述體液中且包含至少一個細胞核的各細胞從所 述體液中分離，并懸浮培養(yǎng)至少24小時W形成球狀體。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述體液是淋己液或血液，更具體而言為外周血。
3. 如在前權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中，所述體液包含完整的紅細胞；并將所 述包含至少一個細胞核的各細胞與所述完整的紅細胞分離，更具體而言通過裂解所述完整 的紅細胞進行所述分離。
4. 如在前權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中，將存在于所述體液中且包含至少一個 細胞核的各細胞從所述體液中分離，而不對該些細胞中的特定細胞進行選擇，將分離的細 胞轉(zhuǎn)移至細胞培養(yǎng)介質(zhì)，并在細胞培養(yǎng)條件下維持在細胞培養(yǎng)介質(zhì)中。
5. 如權(quán)利要求4所述的方法，其中，所述細胞培養(yǎng)條件包括；在35. 5°C -37. 5°C范圍 內(nèi)的溫度、更具體而言在36. 8°C-37. rC范圍內(nèi)的溫度、更具體而言37°C的溫度；W及包含 4. 5% -5. 5%〔化的氣氛、更具體而言包含5% C0 2的氣氛。
6. 如權(quán)利要求4或5所述的方法，其中，多次或定期地將新鮮細胞培養(yǎng)介質(zhì)加入至所述 細胞培養(yǎng)介質(zhì)；或者其中，多次或定期地將所述細胞轉(zhuǎn)移至新鮮細胞培養(yǎng)介質(zhì)。
7. 如在前權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中，將在培養(yǎng)中已形成所述球狀體的腫瘤 細胞從所培養(yǎng)的腫瘤細胞中分離。
8. 根據(jù)如權(quán)利要求7所述的方法培養(yǎng)并存在于球狀體中的腫瘤細胞在檢查所述球狀 體中存在的所述腫瘤細胞的自我更新能力和/或所述球狀體中產(chǎn)生的祖細胞的自我更新 能力方面的用途；和/或測試所述球狀體中的所述腫瘤細胞對用于治療在人或動物中由循 環(huán)上皮腫瘤細胞的產(chǎn)生而引起的腫瘤疾病的藥劑或治療措施的敏感性方面的用途。
9. 如權(quán)利要求8所述的用途，其中，使用針對人上皮抗原化CAM(上皮細胞粘附分子） 的抗體對存在于所述球狀體中的所述腫瘤細胞進行巧光標(biāo)記，隨后使用圖像分析方法進行 分析。
10. 如權(quán)利要求9所述的用途，其中，用能夠被巧光檢測、且特異或優(yōu)先對死細胞進行 染色的物質(zhì)對存在于所述球狀體中的所述腫瘤細胞進行染色，所述物質(zhì)更具體而言為艦化 丙晚。
11. 如權(quán)利要求9或10所述的用途，其中，標(biāo)記、測定和/或染色在化"馨合劑存在的 情況下進行，所述Ca"馨合劑更具體而言為邸TA或EGTA。
12. 如權(quán)利要求8-11中任一項所述的用途，其中，所述治療措施為物理措施，所述物理 措施更具體而言為福射處理或過熱處理；或者，所述治療措施為藥物措施，所述藥物措施更 具體而言為化療、激素治療或抗體治療。
13. 用于在人或動物中對腫瘤疾病進行免疫治療的根據(jù)如權(quán)利要求7所述的方法培養(yǎng) 的形成球狀體的腫瘤細胞。
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于對來自體液的循環(huán)上皮腫瘤細胞亞群體進行培養(yǎng)的方法，所述體液來自罹患上皮腫瘤的人或動物，其中，將所述體液含有的包含至少一個細胞核的各細胞從所述體液中分離，并懸浮培養(yǎng)至少24小時以形成球狀體。
【IPC分類】C12N5-095, G01N33-50
【公開號】CN104685051
【申請?zhí)枴緾N201380050740
【發(fā)明人】烏爾里?！づ潦猜? 卡塔琳娜·帕什曼
【申請人】烏爾里?！づ潦猜? 卡塔琳娜·帕什曼
【公開日】2015年6月3日
【申請日】2013年8月2日
【公告號】DE102012213838A1, EP2880152A1, WO2014020169A1