一種脫鹵酶DhmB及其編碼基因與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種脫鹵酶DhmB及其編碼基因與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 自然界存在大量的鹵代烴、鹵代芳香酸、鹵代鏈烷酸和鹵代醇等含鹵化合物。這 些鹵代有機(jī)物可以用作有機(jī)溶劑、殺蟲(chóng)劑、醫(yī)藥農(nóng)藥中間體等。鹵代有機(jī)物普遍具有環(huán)境 毒性，而且一般比較穩(wěn)定，不易被快速降解，而且容易通過(guò)食物鏈在人與動(dòng)物脂肪組織中積 累，對(duì)人與動(dòng)物的健康造成極大的威脅。
[0003] 脫鹵酶（Dehalogenase，EC3. 8. 1)的作用機(jī)理：能夠催化有機(jī)鹵素化合物中 碳-鹵鍵裂解，使鹵素原子從化合物中釋放出來(lái)。脫鹵酶能夠通過(guò)去除有機(jī)氯農(nóng)藥中的氯， 從而消除其毒性，這對(duì)治理我國(guó)曾大量使用過(guò)的有機(jī)氯農(nóng)藥（二氯苯氧基乙酸、三氯苯酚、 六六六等）的殘留問(wèn)題具有重要應(yīng)用價(jià)值。脫鹵酶可應(yīng)用于糧食、蔬菜、水果，茶葉以及中 成藥中含氯農(nóng)藥殘留的清除和檢測(cè)；脫鹵酶還可應(yīng)用于含氯毒劑（芥子氣）的脫毒處理，這 對(duì)于一些遺留化武無(wú)害處理，保護(hù)環(huán)境安全具有重要意義。
[0004] 當(dāng)前已發(fā)現(xiàn)的脫鹵酶由于在催化活性、酶穩(wěn)定性、產(chǎn)率等方面具有很大缺陷，因此 開(kāi)發(fā)新一代高活力，高穩(wěn)定性以及高效表達(dá)的脫鹵酶具有重要應(yīng)用價(jià)值和社會(huì)意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種蛋白質(zhì)。
[0006] 本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)是如下a)或b)的蛋白質(zhì)：
[0007] a)氨基酸序列是序列表中序列2的蛋白質(zhì)；
[0008] b)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或 缺失和/或添加得到的且與降解鹵素化合物相關(guān)的蛋白質(zhì)。
[0009] 上述一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加為不超過(guò)10個(gè)氨基酸 殘基的取代和/或缺失和/或添加。
[0010] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供與上述蛋白質(zhì)相關(guān)的生物材料。
[0011] 本發(fā)明提供的與上述蛋白質(zhì)相關(guān)的生物材料為下述Bl)-B5)中的任一種：
[0012] B1)編碼上述蛋白質(zhì)的核酸分子；
[0013] B2)含有B1)所述核酸分子的表達(dá)盒；
[0014] B3)含有B1)所述核酸分子的重組載體或含有B2)所述表達(dá)盒的重組載體；
[0015] B4)含有B1)所述核酸分子的重組菌或含有B2)所述表達(dá)盒的重組菌或含有B3) 所述重組載體的重組菌；
[0016] B5)含有B1)所述核酸分子的細(xì)胞系或含有B2)所述表達(dá)盒的細(xì)胞系或含有B3) 所述重組載體的細(xì)胞系。
[0017] 上述生物材料中，所述細(xì)胞系不包括植物和動(dòng)物的繁殖材料。
[0018] 上述生物材料中，B1)所述核酸分子為如下1)或2)或3)的DNA分子：
[0019] 1)其核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；
[0020] 2)與1)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有 85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98 %或至少 具有99%同源性且編碼所述蛋白質(zhì)的DNA分子；
[0021] 3)在嚴(yán)格條件下與1)或2)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白質(zhì)的DNA分子；
[0022] 所述嚴(yán)格條件可為如下：在50°C，7%十二烷基硫酸鈉（SDS)、0. 5MNa3POjPImM EDTA的混合溶液中雜交，在50°C，2XSSC，0. 1%SDS中漂洗；還可為在50°C，在7%SDS、 0. 5MNa3POJPImMEDTA的混合溶液中雜交，在50°C，1XSSC，0. 1%SDS中漂洗；還可為 在 50 °C，7 %SDS、0. 5MNa3POjPImMEDTA的混合溶液中雜交，在 50 °C，0? 5XSSC，0? 1 % SDS中漂洗；還可為在50°C，7%SDS、0. 5MNa3POJPImMEDTA的混合溶液中雜交，在50°C， 0. 1XSSC，0. 1%SDS中漂洗；還可為在 50°C，7%SDS、0. 5MNa3POJPImMEDTA的混合溶液 中雜交，在65°C，0. 1XSSC，0. 1%SDS中漂洗；也可為在65°C，6XSSC，0. 5%SDS的溶液中 中雜交，在 2XSSC，0? 1 %SDS和 1XSSC，0? 1 %SDS各洗膜一次。
[0023] 上述生物材料中，含有B3)所述重組載體的重組菌是將含有B1)所述核酸分子的 重組載體導(dǎo)入宿主菌中得到的；
[0024] 所述含有B1)所述核酸分子的重組載體是將編碼上述蛋白質(zhì)的核酸分子插入表 達(dá)載體，得到表達(dá)上述蛋白質(zhì)的載體。
[0025] 上述蛋白質(zhì)在作為脫鹵酶中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0026] 上述相關(guān)生物材料在制備脫鹵酶中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0027] 上述蛋白質(zhì)或上述相關(guān)生物材料在降解鹵素化合物中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保 護(hù)范圍。
[0028] 上述應(yīng)用中，所述鹵素為氯和/或溴。
[0029] 本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供一種重組菌。
[0030] 本發(fā)明提供的重組菌是將脫鹵酶的編碼基因?qū)胨拗骶械玫降模凰雒擕u酶的 氨基酸序列如序列表中序列2所示。
[0031] 上述重組菌中，所述脫鹵酶的編碼基因是通過(guò)重組載體導(dǎo)入宿主菌的；所述重組 載體是將編碼上述蛋白質(zhì)的核酸分子插入表達(dá)載體，得到表達(dá)上述蛋白質(zhì)的載體；所述脫 鹵酶的編碼基因序列如序列表中序列1所示。
[0032] 上述重組菌中，所述宿主菌具體為大腸桿菌BL21 (DE3)。
[0033] 上述重組菌中，所述表達(dá)載體具體為pET_28a(+)。
[0034] 本發(fā)明最后一個(gè)目的是提供一種酶的表達(dá)方法。
[0035] 本發(fā)明提供的酶的表達(dá)方法包括培養(yǎng)上述重組菌，得到上述脫鹵酶。
[0036] 通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明：本發(fā)明的脫鹵酶DhmB易純化，穩(wěn)定性好，耐受中高溫，最適溫度 65°C，耐受有機(jī)溶劑，不僅能降解低碳鏈的有機(jī)鹵素化合物，還能降解經(jīng)典農(nóng)藥（如DTT和 六六六等），也能降解芥子氣等化學(xué)毒劑。具有廣闊的工業(yè)應(yīng)用前景。
【附圖說(shuō)明】
[0037] 圖1為脫鹵酶DhmB的SDS-PAGE分析純化圖。其中，泳道1為標(biāo)準(zhǔn)分子量；泳道2 為DhmB蛋白表達(dá)；泳道3為洗脫穿透峰；泳道4為DhmB純化結(jié)果。
[0038] 圖2為脫鹵酶DhmB對(duì)不同鹵化底物催化水解研宄。
[0039] 圖3為不同脫鹵酶對(duì)不同底物的催化研宄。
[0040] 圖4為脫鹵酶的⑶（圓二色譜）結(jié)果圖。
[0041 ] 圖5為脫鹵酶DhmB的熱穩(wěn)定性。
[0042] 圖6為脫鹵酶DhmB的最適溫度。
[0043] 圖7為脫鹵酶DhmB的對(duì)有機(jī)溶劑的耐受性。
【具體實(shí)施方式】
[0044] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0045] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0046] 下述實(shí)施例中的猛氧化黃氏菌（Huangiamanganoxydans)的菌株號(hào)為8047,保藏 號(hào)為CGMCCNo. 6697,在公開(kāi)號(hào)為CN103805528A中公開(kāi)過(guò)。
[0047] pET_28a(+)為Novagen公司的產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為69865-3。
[0048] 非變性鎳柱結(jié)合緩沖液I的配方：0.1MTris-H2S04、0. 1MNaCl、0. 01M lmidazole、0. 5mMEDTA、lmMBAM、lmMPMSF;pH為 8.2〇
[0049] 非變性鎳柱洗脫緩沖液II的配方：0.1MTris-H2S04、0. 1MNaCl、0. 5M Imidazole、0.5mMEDTA、lmMBAM、lmMPMSF、pH為 8.2〇
[0050] 實(shí)施例1、DhmB蛋白及其編碼基因的獲得
[0051]以猛氧化黃氏菌（Huangiamanganoxydans) 8047CGMCCNo. 6697 的基因組DNA為 模板，用引物DhmBF和DhmBR進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。弓丨物序列如下（下劃線的 序列為酶切位點(diǎn)）：
[0052]DhmBF：5'-GGAATTCCATATGATGCCCGCTGTCTACGTCTTC-3r；
[0053]DhmBR：5'-CCCAAGCTTTCAGTCCGCGCGCAGGCTGATC-3r。
[0054] 回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、克隆至pGEM-T載體，得到重組載體，將重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5a后送交測(cè)序。
[0055] 測(cè)序結(jié)果表明：該P(yáng)CR擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列如序列表中序列1所示，將該序列所 示的基因命名為DhmB，該基因編碼的蛋白命名為DhmB，DhmB的氨基酸序列如序列表中序列 2所示。
[0056] 實(shí)施例2、脫鹵酶DhmB的獲得及其功能驗(yàn)證
[0057] -、脫鹵酶獲得
[0058]1、重組載體的獲得
[0059] 用限制性內(nèi)切酶對(duì)NdeI和HindIII對(duì)上述實(shí)施例1中獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和 pET-28a(+)載體進(jìn)行雙酶切，連接，得到重組載體pET-DhmB，并送交測(cè)序。
[0060] 測(cè)序結(jié)果表明：pET-DhmB為將pET-28a(+)載體的NdeI和HindIII位點(diǎn)間的DNA 替換為