序列表中序列1所示的DhmB基因，保持pET-28a(+)載體的其他序列不變得到的重 組載體。DhmB基因編碼的蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2所示。
[0061] 2、重組菌的獲得
[0062] 用氯化鈣化學(xué)轉(zhuǎn)化法將步驟2中得到的重組載體pET-DhmB轉(zhuǎn)化至大腸桿菌 BL21(DE3)中，得到重組菌，用含有卡拉霉素（50yg/ml)的LB培養(yǎng)基對重組菌進行篩選培 養(yǎng)，挑取單菌落，提取質(zhì)粒并進行菌落PCR驗證。將含有大小為660bp的DhmB基因的重組 菌，命名為BL21 -pET-DhmB。
[0063] 3、脫鹵酶DhmB的獲得
[0064] 挑取BL21-pET-DhmB的單菌落接入含有卡拉霉素（50yg/ml)的LB培養(yǎng)基中，于 37°C過夜培養(yǎng)。將過夜培養(yǎng)物接種于1L含有卡拉霉素（50yg/ml)的LB培養(yǎng)基，37°C劇烈 振蕩（200rpm)培養(yǎng)，至發(fā)酵液的OD_值達到0. 6-0. 8左右，再向發(fā)酵體系中加入IPTG(終 濃度0. 5mM)，30°C條件下再培養(yǎng)6-8小時。發(fā)酵完畢后，5000rpm離心15分鐘，棄上清，收 集菌體；用非變性鎳柱結(jié)合緩沖液I重懸菌體，超聲波破碎（超聲5s，間歇5s，40w的功率， 30個循環(huán)）后12,OOOrpm離心15min。收集上清液即為含有目的蛋白DhmB的粗酶液。
[0065] 4、脫鹵酶DhmB的純化
[0066] 采用鎳柱親和層析進行純化，在Amersham公司的AKTAFPLC系統(tǒng)中用1ml裝量的 HiTrapchelatingHPcolumn(鎳柱）純化上清。非變性鎳柱結(jié)合緩沖液I用于平衡純化 柱體和上樣。蛋白上樣量為l〇ml，流速設(shè)為lml/min。用20%非變性鎳柱洗脫緩沖液（即 非變性鎳柱結(jié)合緩沖液I和非變性鎳柱洗脫緩沖液II的混合溶液，非變性鎳柱結(jié)合緩沖液 I和非變性鎳柱洗脫緩沖液II的體積比為80 :20)進行洗滌，去除非特異性結(jié)合的雜蛋白。 用80 %非變性鎳柱洗脫緩沖液（即非變性鎳柱結(jié)合緩沖液I和非變性鎳柱洗脫緩沖液II 的混合溶液，非變性鎳柱結(jié)合緩沖液I和非變性鎳柱洗脫緩沖液II的體積比為20 :80)進 行洗脫，收集含洗脫峰的洗脫液，得到純化后的脫鹵酶DhmB，用SDS-PAGE檢測洗脫液中脫 鹵酶DhmB的純度。結(jié)果如圖1所示：脫鹵酶DhmB大小為25kDa左右。
[0067] 二、脫齒酶DhmB性質(zhì)的檢測
[0068] 1、酶活的測定方法
[0069] 脫鹵酶DhmB的酶活測定采用改進的比色分析法。具體方法如下：取步驟一得到的 50ul的純化的脫鹵酶DhmB(0. 2mg/ml)加入到450ul的測活緩沖液中，25°C反應(yīng)30min，冰 上終止反應(yīng)，540nm測定吸光度值。
[0070] 酶活定義：每毫克的酶每分鐘水解底物產(chǎn)生ImMHcl的量定義為一個酶活單位。
[0071] 測活緩沖液的制備方法HEPES、lmMEDTA、20mM硫酸鹽緩沖液、10mM底物、 20ug/ml酚紅；pH8. 2。（沒有特殊要求，底物都用s-2氯丙酸）
[0072] 制作Hcl標準曲線，將脫齒酶DhmB液的測定結(jié)果與Hcl標準曲線比對，得到脫鹵 酶DhmB液的酶活大小。實驗設(shè)3次重復(fù)。
[0073] 2、最適底物
[0074]將二氯乙酸（2-chloroaceticacid)、二溴乙酸（2-bromoaceticacid)、 溴乙酸（BromoaceticAcid)、s_2_ 氯丙酸（S-2-chloropropionicacid)、R-2-氯 乙酸（R_2_chloropropionicacid)、3-氯乙酸（3_chloroaceticacid)、3-溴丙酸 (3-chlooaceticacid)、4_ 氣苯甲酸（4-chlorobenzcicacid)、DTT、六六六和芥子氣模擬 劑2-氯乙基乙基硫醚（2CEES)作為底物，采用步驟1的酶活測定方法測定步驟一得到的脫 鹵酶DhmB的底物專一性。實驗設(shè)3次重復(fù)。
[0075] 結(jié)果如圖2和圖3所示：脫鹵酶DhmB在低碳鏈（CS3)的鹵素化合物中顯示出高 活性：二氯乙酸（100% )，二溴乙酸（96% )，溴乙酸（90% )，S-2-氯丙酸（99% );長鏈活 性沒有短鏈強：4_氯苯甲酸（22% );對氯或者溴的底物沒有傾向性的偏好（圖2);對DTT 和六六六等傳統(tǒng)農(nóng)藥有一定量的降解作用，對芥子氣模擬劑2-氯乙基乙基硫醚（2-CEES) 等化學(xué)毒劑有解毒作用（圖3)。
[0076] 3、熱穩(wěn)定性
[0077] 酶蛋白的變性溫度（Tm值）定義：是在連續(xù)升溫的過程中，50%蛋白發(fā)生變性時所 對應(yīng)的溫度。
[0078] 對不同溫度不同時間的脫鹵酶DhmB酶液的酶活進行測定。測定的方法：用圓二色 譜儀（⑶(circulardichroism))測定不同溫度和不同時間處理后的脫齒酶DhmB的Tm值。 處理后在冰上放lOmin，然后開始測酶活。實驗設(shè)3次重復(fù)。
[0079] 結(jié)果如圖4和圖5所示：脫鹵酶DhmB的Tm值68. 8 °C，脫鹵酶DhmB酶液在50 °C以 下處理，酶活穩(wěn)定。
[0080] 4、最適溫度
[0081] 比較步驟一中獲得的脫鹵酶DhmB在不同溫度下的酶活大小，得到脫鹵酶DhmB的 最適溫度。最適溫度的測定是在不同溫度下進行酶促反應(yīng)。
[0082] 結(jié)果如圖6所示：脫鹵酶DhmB在60-70°C條件下的酶活很高，最適溫度為65°C，屬 于中高溫酶。
[0083] 5、溶劑穩(wěn)定性
[0084] 測定步驟一中獲得的脫鹵酶DhmB的溶劑穩(wěn)定性：將脫鹵酶DhmB分別在不同溶劑 (甲醇，乙醇，二甲基亞砜DMS0和乙睛），不同質(zhì)量分數(shù)（10% -70% )下室溫處理1小時。 然后采用步驟1的方法測定脫鹵酶的酶活。
[0085] 結(jié)果如圖7所示：脫鹵酶DhmB在有機溶劑中，比較穩(wěn)定。
【主權(quán)項】
1. 蛋白質(zhì)，是如下a)或b)的蛋白質(zhì)： a)氣基酸序列是序列表中序列2的蛋白質(zhì)； b) 將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失 和/或添加得到的且與降解鹵素化合物相關(guān)的蛋白質(zhì)。
2. 與權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)相關(guān)的生物材料，為下述BI)-B5)中的任一種： BI)編碼權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的核酸分子； B2)含有BI)所述核酸分子的表達盒； B3)含有BI)所述核酸分子的重組載體或含有B2)所述表達盒的重組載體； B4)含有BI)所述核酸分子的重組菌或含有B2)所述表達盒的重組菌或含有B3)所述 重組載體的重組菌； B5)含有BI)所述核酸分子的細胞系或含有B2)所述表達盒的細胞系或含有B3)所述 重組載體的細胞系。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的相關(guān)生物材料，其特征在于：B1)所述核酸分子的為如下1) 或2)或3)的DNA分子： 1) 其核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子； 2) 與1)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、 至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98 %或至少具有 99%同源性且編碼所述蛋白質(zhì)的DNA分子； 3) 在嚴格條件下與1)或2)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白質(zhì)的DNA分子。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的相關(guān)生物材料，其特征在于：含有B3)所述重組載體的 重組菌是將含有BI)所述核酸分子的重組載體導(dǎo)入宿主菌中得到的； 所述含有BI)所述核酸分子的重組載體是將編碼權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的核酸分子插 入表達載體，得到表達權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的載體。
5. 權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)在作為脫鹵酶中的應(yīng)用。
6. 權(quán)利要求2-4中任一所述相關(guān)生物材料在制備脫鹵酶中的應(yīng)用。
7. 權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)或權(quán)利要求2-4中任一所述相關(guān)生物材料在降解鹵素化合物 中的應(yīng)用； 所述鹵素具體為氯和/或溴。
8. -種重組菌，是將脫鹵酶的編碼基因?qū)胨拗骶械玫降?；所述脫鹵酶的氨基酸序 列如序列表中序列2所示。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的重組菌，其特征在于：所述脫鹵酶的編碼基因是通過重組載 體導(dǎo)入宿主菌的； 所述重組載體是將編碼權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的核酸分子插入表達載體，得到表達權(quán) 利要求1所述蛋白質(zhì)的載體； 所述脫鹵酶的編碼基因序列如序列表中序列1所示。
10. -種酶的表達方法，包括培養(yǎng)權(quán)利要求8或9所述的重組菌，得到脫鹵酶。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種脫鹵酶DhmB及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明的脫鹵酶DhmB是如下a)或b)的蛋白質(zhì)：a)氨基酸序列是序列表中序列2的蛋白質(zhì)；b)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的且與脫鹵相關(guān)的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的脫鹵酶DhmB易純化、穩(wěn)定性好、耐受中高溫、最適溫度65℃、耐受有機溶劑且能降解低碳鏈的有機鹵素化合物、經(jīng)典農(nóng)藥及化學(xué)毒劑等，具有廣闊的工業(yè)應(yīng)用前景。
【IPC分類】A62D3-02, C12N15-70, C12N1-21, A62D101-22, C12N9-14, C12N15-55
【公開號】CN104694514
【申請?zhí)枴緾N201510119494
【發(fā)明人】董志揚, 董亮, 戴欣, 張山, 王麗, 張巖峰
【申請人】中國科學(xué)院微生物研究所
【公開日】2015年6月10日
【申請日】2015年3月18日