表達海腎或螢火蟲熒光素酶基因的prrsv重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法以及應(yīng)用
【專利說明】表達海腎或螢火蟲熒光素酶基因的PRRSV重組質(zhì)粒的構(gòu)建 方法以及應(yīng)用
【背景技術(shù)】：
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，具體地說，涉及一種病毒的重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法和應(yīng) 用，更具體地說，涉及到能夠表達海腎和螢火蟲熒光素酶的豬繁殖與呼吸綜合征病毒重組 質(zhì)粒的構(gòu)建與其在指征PRRSV復(fù)制水平上的應(yīng)用。
[0002] 豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS) 是一種嚴重影響?zhàn)B豬業(yè)的接觸性傳染病，給世界各國造成的經(jīng)濟損失巨大。其病原PRRSV 一直處于不斷的變異及進化過程中。目前，反向遺傳操作被廣泛應(yīng)用于研宄PRRSV的生物 學特性、致病機理、毒力決定因子以及不斷變異的分子機制，而其基因組作為外源基因表達 載體的研宄也被廣泛開展。PRRSV的基因組中除0RF1和0RF2以及0RF4和0RF5外，其結(jié)構(gòu) 蛋白編碼框架之間有少則幾個多則逾百的堿基重疊（overlap)。相關(guān)研宄表明：0RF重疊區(qū) 的影響會導(dǎo)致嵌合病毒失去感染性，因此可選擇非重疊區(qū)或者將重疊區(qū)拉開作為外源基因 的插入位點。需要注意的是外源基因的插入原則應(yīng)以能在最小程度上改變病毒基因組為基 礎(chǔ)。但即便如此，插入外源基因也會在傳代過程中逐漸丟失編碼序列以致無法發(fā)揮其功能。 呈現(xiàn)遺傳不穩(wěn)定性。Dr. DongwanYoo 2009年報道了其在ORFlb和0RF2之間插入了 GFP基 因，如果在其3'端下游插入一個二級結(jié)構(gòu)簡單的（由其自身及周圍序列形成）轉(zhuǎn)錄調(diào)控序 列6(TRS6)的拷貝，讓外源基因的表達被一個獨立的轉(zhuǎn)錄子所引導(dǎo)。所構(gòu)建的突變體克隆 能夠在至少37代次的傳達過程中保遺傳穩(wěn)定。Dr. Chengbao Wang的研宄則表明TRS6拷貝 的插入同樣能夠使在其他位點插入的外源序列穩(wěn)定。而Dr. Dongwan Yoo在構(gòu)建時在外源基 因插入點的5'端和3'端分別引入了兩個外源的酶切位點Afl II和Mlu I，以方便下游的 替換或者插入操作，但是這或多或少可能對親本病毒的生物學特性造成影響。Dr. Chengbao Wang所依賴的反向遺傳操作系統(tǒng)是細菌人工染色體，而其外源基因的插入位點在0RF7和 3' UTR之間。這個位點并沒有編碼基因的重疊，另外0RF7編碼的是PRRSV病毒表達量最 大的核衣殼蛋白（N protein)，因此這里也是外源基因插入的一個很好的選擇。而他們同樣 選取了 TRS6作為外源基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列。在TRS6的引導(dǎo)下，GFP這個外源基因仍然得 到了很好的穩(wěn)定的表達。
[0003] 熒光素酶（英文名稱：Luciferase)是自然界中能夠產(chǎn)生生物熒光的酶的統(tǒng)稱，其 中最有代表性的是一種學名為Photinus pyrail的螢火蟲體內(nèi)的焚光素酶。在相應(yīng)的化 學反應(yīng)中，熒光的產(chǎn)生是來自于熒光素的氧化，有些情況下反應(yīng)系統(tǒng)中也包括三磷酸腺苷 (ATP)。螢火蟲發(fā)出的淡黃綠色的光是由其體內(nèi)的熒光素酶產(chǎn)生的，這并不是一個簡單的過 程，早在很久以前，人們就已經(jīng)通過對細菌、真菌、?？拔灮鹣x的研宄，發(fā)現(xiàn)了生物的發(fā)光 現(xiàn)象。熒光素酶的輔因子，即熒光素，能與氧結(jié)合形成一個高度緊張的復(fù)合物，當這個氧化 物在ATP的參與下被破壞時，產(chǎn)生C02,從而形成具有較高活性的形式，即可發(fā)光。與02結(jié)合 的是熒光素酶中的熒光素，222酶蛋白種類多樣，決定了熒光素也有不同的大小和形狀。對 發(fā)光系統(tǒng)進行分析發(fā)現(xiàn)熒光素或熒光素酶不是特定的分子，而是對于所有能夠產(chǎn)生熒光的 底物和其對應(yīng)的酶的統(tǒng)稱，雖然它們各不相同，不同的能夠控制發(fā)光的生物體用不用的熒 光素酶來催化不同的發(fā)光反應(yīng)，最為人所知的發(fā)光生物是螢火蟲，另外目前應(yīng)用比較廣泛 的海腎熒光素酶的生物體海腎。在本發(fā)明中，所插入的海腎熒光素酶基因來源于PGMR-TK， 其編碼基因為936bp，螢火蟲熒光素酶基因來源于pGL3-Basic，編碼基因長度為1653bp。
[0004] 在本發(fā)明中，在高致病性藍耳病細胞致弱疫苗株HuN4-Fl 12的全長感染性克隆骨 架的ORFlb和ORF2a之間分別插入了海腎熒光素酶基因和螢火蟲熒光素酶基因，獲得了能 夠穩(wěn)定表達這兩個熒光素酶基因的重組PRRSV :pA-Rluc和pA-Fluc，對其進行一系列病毒 特性分析及遺傳穩(wěn)定性檢測；并在病毒復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯水平對其與親本病毒進行比較分 析。并通過用這兩個帶有熒光素酶基因的突變病毒vA-Rluc和vA-Fluc感染MARC-145和 PAM之后，收取細胞裂解物對其進行熒光素酶活性檢測的方法對病毒在細胞上的復(fù)制水平 進行比較分析，對其作為指征病毒復(fù)制水平的一種指標進行評估。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0005] 本發(fā)明的目的在于，提供表達海腎熒光素酶和螢火蟲熒光素酶基因的PRRSV重組 質(zhì)粒的構(gòu)建方法。
[0006] 本發(fā)明的構(gòu)建表達海腎熒光素酶和螢火蟲熒光素酶基因的PRRSV重組質(zhì)粒的方 法，為根據(jù)pGMR-TK海腎熒光素酶報告基因載體和pGL3-Basic螢火蟲熒光素報告基因載 體中的兩個熒光素酶基因序列（上述兩個熒光素酶載體均購自上海吉滿生物科技有限公 司）以及高致病性藍耳病細胞致弱疫苗株HuN4-F112的基因序列設(shè)計SOE PCR引物，在 HuN4_F112的ORFlb和0RF2之前分別插入Renilla和Firef ly Luciferase基因，并在外源 基因3'端下游插入此病毒的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列6(TRS6)。將擴增出的兩個嵌合片段通過Asc I 和EcoR V雙酶切，然后回收PCR產(chǎn)物連接到HuN4-F112的Asc I和EcoR V雙酶切載體上， 從而獲得了兩個嵌合重組質(zhì)粒pA-Rluc和pA-Fluc〇
[0007] 本發(fā)明的嵌合海腎熒光素酶和螢火蟲熒光素酶的PRRSV的基因工程重組質(zhì) 粒，是能夠穩(wěn)定表達海腎焚光素酶（Renilla Luciferase)或螢火蟲焚光素酶（firefly Luciferase)的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒細胞傳代致弱株HuM-Fl 12的嵌合重組 質(zhì)粒。
[0008] 本發(fā)明的表達 Renilla Luciferase 或 firef ly Luciferase 的 PRRSV 基因工 程重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法包括以下步驟：首先通過SOE PCR的方法擴增出含有Renilla Luciferase或firefly Luciferase的PRRSV突變片段，然后將擴增出的PCR片段和高致病 性藍耳病細胞傳代致弱疫苗株HuN4-Fl 12進行Asc I和EcoR V酶切，最后將酶切后的突變 PCR片段和HuN4-F112的雙酶切片段進行連接，并轉(zhuǎn)化T0P10感受態(tài)細胞，然后通過篩選獲 得基因工程重組質(zhì)粒pA-Rluc和pA-Fluc，從而提供了相應(yīng)的構(gòu)建方法。
[0009] 使用本發(fā)明所構(gòu)建的重組質(zhì)粒pA-Rluc和pA-Fluc，轉(zhuǎn)染MARC-145細胞后所拯救 出來的病毒具有和親本病毒vHuN4-Fl 12相似的病毒生物學特性。并且在至少連續(xù)15代次 的傳代過程中能夠保持遺傳穩(wěn)定性。不同M0I感染MARC-145細胞或者PAM細胞不同時間 點后，收集細胞，通過裂解細胞檢測熒光素酶活性值可以對PRRSV在MARC-145或者PAM上 的復(fù)制水平進行分析比較，評估其作為指征PRRSV復(fù)制水平的另外一種指標的可行性。結(jié) 果證明這種方法是可行的。較之其他的方法有一定的簡便性和優(yōu)越性。
【附圖說明】
[0010] 圖1是pA-Rluc和pA-Fluc嵌合重組質(zhì)粒的構(gòu)建示意圖
[0011] 圖 2 是 SOE PCR 引物擴增 Renilla Luciferase 或 firefly Luciferase 不同的 PCR片段的電泳檢測結(jié)果，其中，圖2a為由pHuN4-F112為模板，引物HF11559和Rluc-Rl/ Fluc-Rl 獲得的長度約為 450bp 的兩個 PCR 產(chǎn)物 Rluc-SOE-1/Fluc-SOE-l 和以 pHuN4-F112 為模板，引物Rluc-F4/Fluc-F4和HR13090獲得的長度約為1100bp的PCR片段Rluc-SOE-4/ Fluc-SOE-4 :圖 2a 中另有為分別由 pGMR-TK 和 pGL3-Basic 為模板，Rluc-F2/Fluc-F2 和 Rluc-R2/R3/Fluc-R2/R3為上下游引物所獲得的分別為935bp和1700bp左右的PCR產(chǎn) 物Rluc-S0E-2/Fluc-S0E-2 ;圖2b為以S0E-1和S0E-2回收產(chǎn)物為模板，引物HF11559 和Rluc-R2/R3/Fluc-R2/R3為上下游引物擴增出的1440bp和2200bp長度的PCR產(chǎn)物 Rluc-S0E-3/Fluc-S0E-3 ;圖2c為由S0E-3和S0E-4的回收產(chǎn)物為模板，引物HF11559和 HR13090 擴增出的分別為 2540bp 和 3300bp 長度的 PCR 產(chǎn)物 Rluc-S0E-5/Fluc-S0E-5 ;圖 2d 為由S0E-5產(chǎn)物的EcoR V和Asc I雙酶切電泳結(jié)果。
[0012] 圖3a是構(gòu)建好的嵌合重組質(zhì)粒pA-Rluc、pA-Fluc以及親本質(zhì)粒pHuN4-F112的 EcoR V和Asc I雙酶切鑒定結(jié)果，圖3b是對嵌合重組質(zhì)粒的Swa I線性化電泳結(jié)果，圖3c 是對線性化模板的體外轉(zhuǎn)錄RNA的電泳鑒定。