數(shù)為：95°C預(yù)變性2min，95°C變性20s，60°C退火20s，72°C延伸15s，共 進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，然后72°C延伸3min。
[0051] 取PCR反應(yīng)產(chǎn)物，用1. 2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖2a所示，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果， 獲得的目的片段大小為450bp。
[0052] 1. 1. 2擴(kuò)增S0E-2PCR產(chǎn)物
[0053]以pGMR-TK和pGL3-Basic質(zhì)粒為模板，引物Rluc-F2/Fluc-F2和Rluc-R2/R3/ Fluc-R2/R3分別作為上游引物和下游引物，PCR擴(kuò)增S0E-2,具體如下：
[0054] PCR反應(yīng)體系為：pGMR-TK和pGL3-Basic質(zhì)粒100倍稀釋物lyL，上下游引物 ^(lOyM) lOXpfu Buffer 5yL,2. 5mM dNTP 2yL, pfu II Turbo DNA 5units，加水至50 y L。
[0055] PCR反應(yīng)參數(shù)為：95°C預(yù)變性2min，95°C變性20s，56°C退火20s，72°C延伸20s，進(jìn) 行35個(gè)循環(huán)，再72°C延伸3min。
[0056] 取PCR反應(yīng)產(chǎn)物，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖2b所示，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，獲 得的目的片段大小分別為935bp和1700bp。
[0057] 1. 1. 3擴(kuò)增S0E-4PCR產(chǎn)物
[0058] PCR反應(yīng)體系為：以pHuN4-F112作為模板，以Rluc-F4/Fluc-F4和HR13090上下 游引物對(duì)（l〇yM)各 lyL，10Xpfu Buffer 5yL，2.5mM dNTP 2yL，pfu II Turbo DNA 聚 合酶5units，加水至50 y L。
[0059] PCR反應(yīng)參數(shù)為：95°C預(yù)變性2min，95°C變性20s，60°C退火30s，72°C延伸20s，進(jìn) 行35個(gè)循環(huán)，再72°C延伸3min。
[0060] 取PCR反應(yīng)產(chǎn)物，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖2a所示，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，獲 得的目的片段大小為ll〇〇bp。
[0061] 1. 1. 4 擴(kuò)增 S0E-3PCR 產(chǎn)物
[0062] PCR反應(yīng)體系為：以S0E-1和S0E-2PCR回收產(chǎn)物作為模板，以HF11559和Rluc-R2/ R3/Fluc-R2/R3 上下游引物對(duì)（10yM)各 lyL，10Xpfu Buffer 5yL，2.5mM dNTP 2yL， pfu II Turbo DNA 聚合酶 5units，加水至 50yL。
[0063] ?0?反應(yīng)參數(shù)為：95°0預(yù)變性2!^11，951：變性2〇8,561：退火2〇8,721：延伸3〇8進(jìn) 行35個(gè)循環(huán)，再72°C延伸3min。
[0064] 取PCR反應(yīng)產(chǎn)物，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖2c所示，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，獲 得的目的片段大小分別為1440bp和2200bp。
[0065] 1. 1. 5 擴(kuò)增 S0E-5PCR 產(chǎn)物
[0066] PCR反應(yīng)體系為：以S0E-3和S0E-4PCR回收產(chǎn)物作為模板，以HF11559和HR13090 上下游引物對(duì)（l〇yM)各 lyL，10Xpfu Buffer 5yL，2.5mM dNTP 2yL，pfu II Turbo DNA聚合酶5units，加水至50 y L。
[0067] PCR反應(yīng)參數(shù)為：95°C預(yù)變性2min，95°C變性20s，56°C退火20s，72°C延伸45s，進(jìn) 行35個(gè)循環(huán)，再72°C延伸3min。
[0068] 取PCR反應(yīng)產(chǎn)物，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖2d所示，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，獲 得的目的片段大小分別為2540和3300bp。
[0069] 2. 2表達(dá)海腎熒光素酶或熒光蟲熒光素酶重組PRRSV質(zhì)粒的構(gòu)建
[0070] 將上述S0E-5的PCR產(chǎn)物使用Asc I/EcoR V進(jìn)行雙酶切，結(jié)果見圖2c再與經(jīng)過 Asc I和EcoR V雙酶切的親本病毒全長(zhǎng)質(zhì)粒pHuN4-F112的大片段通過T4DNA連接酶連按， 經(jīng)測(cè)序鑒定后篩選出陽(yáng)性克隆，獲得pA-Rluc(SEQ ID NO. 11)和pA-Fluc(SEQ ID NO. 12)， 構(gòu)建策略如圖3所示。
[0071] 具體步驟如下：
[0072] 于37°C水浴中，用Asc I/EcoR V分別對(duì)S0E-5的PCR產(chǎn)物和親本病毒全長(zhǎng)質(zhì)粒 pHuN4-F112進(jìn)行雙酶切，反應(yīng)體系為S0E-5突變片段41yL，Asc I 2yL，EcoR V 2yL， 10 X NEB Buffer4 5 y L ；pHuN4-F112 15 yL, Asc I 2 y L, EcoR V 2yL, 10XNEB Buffer4 5 u L，ddH2026 u L。
[0073] 將SOE-5的PCR產(chǎn)物和相應(yīng)的載體的Asc I/EcoR V雙酶切片段以摩爾比3 : 1 的比例，以T4DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化T0P10,挑取獨(dú)立的菌落進(jìn)行純培養(yǎng)，提取質(zhì)粒DNA，1% 凝膠電泳，挑取大小為18kb的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，篩選陽(yáng)性克隆。
[0074] 對(duì)所獲得的待鑒定質(zhì)粒進(jìn)行Asc I/EcoR V雙酶切檢測(cè)酶切條帶是否正確，酶切體 系參照如上，37°C水浴酶切過夜。對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行電泳鑒定，結(jié)果見圖3a所示，
[0075] 1.3病毒RNA的制備
[0076] 1. 3. 1質(zhì)粒的Swa I線性化
[0077] 于37°C水浴中，用Swa I分別對(duì)嵌合重組質(zhì)粒pA-Rluc、pA-Fluc以及親本質(zhì)粒 pHuN4-F112進(jìn)行線性化酶切（反應(yīng)體系為：突變質(zhì)粒41. 5 y L，Swa I 3 y L，ddH20 0 y L， 100XBSA 0.5yL，10XNEB Buffer3 5yL)，酶切過夜。參考說明書的方法，用 QIAquick PCR Purification Kit純化酶切產(chǎn)物，分別獲得純化的線性化質(zhì)粒，見圖3。
[0078] 1. 3. 2、體外轉(zhuǎn)錄
[0079]參考說明書的方法，使用 ITmMESSAGE High Yield Capped RNA Transcription Kit (購(gòu)自Ambion公司）體外轉(zhuǎn)錄純化后的線性化質(zhì)粒，并采用RNA電泳鑒定，根據(jù)鑒定結(jié) 果，見圖3,獲得了 pA-Rluc、pA-Fluc的體外轉(zhuǎn)錄RNA。
[0080] 1. 4表達(dá)海腎熒光素酶或螢火蟲熒光素酶的PRRSV重組質(zhì)粒的檢測(cè)
[0081] 1.4.1RNA 的轉(zhuǎn)染
[0082] 接種MARC-145細(xì)胞（非洲綠猴腎細(xì)胞系，購(gòu)自美國(guó)ATCC)于六孔板中培養(yǎng)，待 細(xì)胞密度為80-90%時(shí)，向每孔中分別加入pA-Rluc、pA-Fluc的in vitro RNA和2uL DMRIE-C轉(zhuǎn)染試劑，在lmL的Opti-MEM中振蕩混勻，然后根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑說明書的方法，轉(zhuǎn)染 MARC-145細(xì)胞，并且逐日觀察細(xì)胞病變。
[0083] 待出現(xiàn)如圖4所示的細(xì)胞病變（CPE)后，收取上清并傳代，上清收取及傳代過程具 體如下：
[0084] MARC-145細(xì)胞在含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)基的六孔板中貼壁長(zhǎng)滿單層后，棄培 養(yǎng)基，PBS洗兩遍，吸取轉(zhuǎn)染過后五天的上清液，將其與維持液（含2% FBS的DMEM)按照 1 : 10的比例接種上清液200 UL，置37°C繼續(xù)培養(yǎng)并采用上述方法繼續(xù)傳代，并收取第五 代的病毒上清，然后按照QIAGEN公司RNA提取試劑盒中的操作方法提取上清病毒RNA，獲得 病毒 vA_Rluc、vA_Fluc〇
[0085] 根據(jù)上述結(jié)果，獲得的重組質(zhì)粒pA-Rluc和pA-Fluc具有感染性，能夠從單一的基 因組序列成功轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂谢钚缘牟《玖Ｗ硬⒕哂邢鄳?yīng)的病毒感染性。
[0086] 1. 4. 2、間接免疫熒光檢測(cè)
[0087] 按照實(shí)施例1. 4. 1中的RNA轉(zhuǎn)染步驟，分別以純化后1000倍稀釋的病毒vA-Rluc、 vA-Fluc，感染單層MARC-145細(xì)胞，然后于感染36h后棄去培養(yǎng)基，用冰甲醇固定10min，1 % BSA室溫封閉30min，用PRRSV核衣殼蛋白的特異性單抗（1 : 800稀釋）室溫孵育2h，再加 入羅丹明標(biāo)記的羊抗鼠的二抗室溫孵育lh，PBS洗五遍后，在熒光顯微鏡下觀察，結(jié)果如圖 5所示。
[0088] 根據(jù)圖4的結(jié)果：vA_Rluc和vA-Fluc于轉(zhuǎn)染后第5天出現(xiàn)了明顯的CPE，以無限 稀釋法傳代純化嵌合病毒vA-Rluc和vA-Flue，并且以間接免疫熒光分別檢測(cè)感染嵌合病 毒vA-Rluc和vA-Fluc 36h后的MARC-145細(xì)胞，結(jié)果出現(xiàn)了抗N蛋白的特異性熒光。
[0089] 同時(shí)，利用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)原代（P0)和子代（P5和P10)病毒，結(jié)果顯示，這兩個(gè) 熒光素酶基因能夠分別穩(wěn)定存在于PRRSV基因組中。
[0090] 上述結(jié)果說明：利用反向遺傳操作系統(tǒng)獲得了和親本毒VHUN4-F112具有相似生 長(zhǎng)特性的表達(dá)海腎熒光素酶和螢火蟲熒光素酶的PRRSV嵌合全長(zhǎng)重組質(zhì)粒，同時(shí)證明在外 源基因的插入不影響整個(gè)病毒的生長(zhǎng)，是可行的。
[0091] 1. 4. 3病毒細(xì)胞半數(shù)感染量（TCID5(I)測(cè)定
[0092]參照Piz