4]圖10.治療后的SMA小鼠中生殖能力的恢復(fù)
[0045]與IV注射小鼠相比，在ICV或ICV/IV注射后的SMN Δ 7雌性小鼠中，在恢復(fù)的生殖能力方面觀察到了顯著的益處。在ICV/IV和ICV治療組中，100%的雌性小鼠是可繁殖的，相反，IV治療的小鼠不能自我繁殖。
[0046]圖11.野牛塑小鼠和AAVlO-hSMNopti ICV/IV共注射的hSMN2小鼠的存活和體重表型的比較
[0047]與未治療的小鼠相比，AAV10ICV/IV共注射小鼠的體重?fù)p失表型和存活得到了相當(dāng)大的改善，特別是在日齡為209和36天的兩只小鼠中。未治療的小鼠從來沒有度過6天的日齡(存活中值~ 3天)。
[0048]發(fā)曰月詳沐
[0049]對于多系統(tǒng)疾病例如麗疾病(例如，脊髓性肌萎縮(SM)或肌萎縮性側(cè)索硬化癥(ALS))或溶酶體疾病的治療來說，向神經(jīng)系統(tǒng)和外周組織兩者的廣泛的基因遞送是重大的挑戰(zhàn)。在此，我們描述了一種新的基因轉(zhuǎn)移方法，其允許在向哺乳動(dòng)物的血液和CSF單次聯(lián)合注射病毒載體之后獲得神經(jīng)系統(tǒng)(中樞和外周兩者)和外周器官的有效轉(zhuǎn)導(dǎo)。具體來說，我們在小鼠中靜脈內(nèi)(“1.v.”或“IV”)和腦室內(nèi)(“1.c.v.”或“ICV”)注射tAAV載體，并在嚴(yán)重(hSMN2)和較不嚴(yán)重(SMNA7)的SMA小鼠模型兩者中獲得了比單一 ICV注射之后更高和更顯著的臨床益處。對于SMNA 7小鼠觀察到了體重增加方面的改善，并在兩種hSMN2小鼠中均觀察到了存活和體重增加兩者的改善。與IV注射小鼠相比，在較不嚴(yán)重的SMNA 7小鼠模型中觀察到了恢復(fù)的生殖能力方面的額外益處。可以在脊髓、背部感覺纖維和背根神經(jīng)節(jié)的麗和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中以及在心臟或肝臟中發(fā)現(xiàn)治療基因的表達(dá)。
[0050]因此，本發(fā)明提供可用于通過病毒介導(dǎo)的基因療法治療多系統(tǒng)疾病的新的改進(jìn)方法。
[0051]可轉(zhuǎn)移的病毒載體
[0052]在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“病毒載體”指包含病毒組分或源自于病毒組分并適合于感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞(優(yōu)選人細(xì)胞)的任何載體。通常，病毒載體包含被包裝在病毒衣殼或包膜中的重組病毒基因組。
[0053]“可轉(zhuǎn)移的”病毒載體指在CSF注射后能夠在生物體的CNS和非CNS區(qū)域中擴(kuò)散的病毒載體。具體來說，可轉(zhuǎn)移的病毒載體能夠在注射到CSF中之后擴(kuò)散并轉(zhuǎn)導(dǎo)外周器官的細(xì)胞，這通常通過穿過或繞過BBB來實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明確實(shí)證明了病毒載體能夠表現(xiàn)出這種能力并且能夠在CNS注射后以高效率轉(zhuǎn)導(dǎo)外周器官例如心臟、肝臟或腎臟。
[0054]本發(fā)明的可轉(zhuǎn)移的病毒載體可源自于各種類型的病毒。如在下面所公開的，在最優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的病毒載體是AAV載體。
[0055]術(shù)語AAV載體通常指包含至少一種編碼治療產(chǎn)物(例如，蛋白、肽、或RNA序列如反義序列)的核酸分子(基因組)的AAV病毒粒子(或毒粒)。如在下面所討論的，AAV可源自于包括血清型組合(即，“假型”AAV)的各種血清型，或源自于各種基因組(例如，單鏈或自身互補(bǔ)的)。此外，AAV載體可以是復(fù)制缺陷型和/或靶向AAV載體。
[0056]腺相關(guān)病毒(AAV)是約20納米大小的依賴性微小病毒。如同其他的微小病毒，AAV是單鏈的無包膜DNA病毒，具有約5000核苷酸長度的基因組，含有兩個(gè)開放閱讀框。左側(cè)的開放閱讀框編碼負(fù)責(zé)復(fù)制的蛋白(Rep)，而右側(cè)的開放閱讀框編碼衣殼的結(jié)構(gòu)蛋白(Cap)。開放閱讀框的兩側(cè)有兩個(gè)ITR序列，其充當(dāng)病毒基因組的復(fù)制起點(diǎn)。此外，基因組還含有包裝序列，允許將病毒基因組包裝到AAV衣殼中。
[0057]AAV需要共輔助功能(其可由例如腺病毒或合適的包裝細(xì)胞或輔助質(zhì)粒提供)以在培養(yǎng)細(xì)胞中進(jìn)行生產(chǎn)性感染。在這種輔助功能不存在時(shí)，AAV毒?；旧线M(jìn)入細(xì)胞、作為單鏈DNA分子迀移到細(xì)胞核、并且整合到細(xì)胞基因組中。AAV具有易感染的廣泛宿主范圍(包括人類細(xì)胞)，在人類中普遍存在，并且完全是非致病性的。
[0058]AAV載體已被設(shè)計(jì)、生產(chǎn)和用于介導(dǎo)人類對象中的基因遞送，包括用于治療目的。使用AAV載體的臨床試驗(yàn)?zāi)壳霸诙鄠€(gè)國家進(jìn)行。通常，用在基因轉(zhuǎn)移中的AAV載體包含缺少功能性Rep和Cap編碼病毒序列的復(fù)制缺陷型AAV基因組。這種復(fù)制缺陷型AAV載體更優(yōu)選地缺少大部分或全部的Rep和Cap編碼序列，并且基本上保留一個(gè)或兩個(gè)AAV ITR序列和包裝序列。缺陷型基因組被包裝在病毒粒子中，以形成缺陷型重組AAV病毒，也稱作“AAV載體”。
[0059]文獻(xiàn)中已經(jīng)公開了生產(chǎn)這種AAV載體的方法，包括使用包裝細(xì)胞、輔助性病毒或質(zhì)粒、和 / 或桿狀病毒系統(tǒng)(Samulski 等，(1989) J.Virology 63，3822 ;Xiao 等，(1998)J.Virology 72，2224 ;Inoue 等，(1998)J.Virol.72, 7024；W098/22607 ；W02005/072364)o也已經(jīng)報(bào)道了生產(chǎn)假型AAV載體的方法(例如，W000/28004),以及AAV載體的各種修飾或制劑，以在體內(nèi)施用后降低它們的免疫原性(參見例如，W001/23001 ；W000/73316 ；W004/112727 ；W005/005610 ；W099/06562)。
[0060]AAV載體可從AAV的各種血清型制備或得到，所述AAV的各種血清型甚至可以被混合在一起或與其他類型的病毒混合，以生產(chǎn)嵌合的(例如假型)AAV病毒。
[0061]tAAV的優(yōu)選實(shí)例是人AAV4載體、人AAV7載體、人AAV9載體、人AAV10載體、或牛AAV載體。
[0062]AAV載體可源自于單一的AAV血清型或包含來自至少兩種不同的AAV血清型的序列或組分(假型AAV載體)，例如包含源自于一種AAV血清型(例如AAV9)的AAV基因組和至少部分源自于不同的AAV血清型的衣殼的AAV載體。
[0063]AAV載體的具體實(shí)例為:
[0064]-在AAV9來源的衣殼中包含AAV9來源的基因組(包含可操作地連接于編碼治療性蛋白的核酸的AAV9來源的ITR和AAV9來源的包裝序列的核酸分子，優(yōu)選地兩個(gè)AAV9來源的ITR在AAV9來源的包裝序列和編碼治療性蛋白的核酸的兩側(cè))的載體；
[0065]-在AAV10來源的衣殼中包含AAV10來源的基因組的載體；
[0066]-在AAV10來源的衣殼中包含AAV9來源的基因組的載體；
[0067]-在AAV9來源的衣殼中包含AAV10來源的基因組的載體；
[0068]-在AAV10來源的衣殼中包含AAV2來源的基因組的載體；
[0069]-在AAV9來源的衣殼中包含AAV2來源的基因組的載體；
[0070]-在牛AAV來源的衣殼中包含牛AAV來源的基因組的載體。
[0071]AAV載體可包含修飾的衣殼，包括非病毒起源或結(jié)構(gòu)修飾的蛋白或肽，以改變載體的向性。作為具體的實(shí)例，衣殼可包括特定受體的配體或特定配體的受體，以將載體分別靶向表達(dá)所述受體或配體的細(xì)胞類型。
[0072]在本發(fā)明中使用的AAV載體中，AAV基因組可以是單鏈核酸或雙鏈、自身互補(bǔ)的核酸(McCarty等，Gene Therapy，2001)，更優(yōu)選為自身互補(bǔ)的核酸。
[0073]用于本發(fā)明的最優(yōu)選的病毒載體是scAAV9載體、ssAAV9載體、scAAV1載體或ssAAV1 載體。
[0074]如上所討論的，AAV來源的基因組包含編碼治療產(chǎn)物(例如，蛋白或RNA)的核酸。通常，核酸也包含允許表達(dá)、優(yōu)選地分泌編碼的蛋白的調(diào)節(jié)序列，例如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、多腺苷酸化信號、內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)、編碼蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(PTD)的序列等。在這一方面，核酸最優(yōu)選地包含可操作地連接于編碼序列的啟動(dòng)子區(qū)域，以引起或提高治療性蛋白在感染細(xì)胞中的表達(dá)。這樣的啟動(dòng)子可以是普遍存在的、組織特異性的、強(qiáng)的、弱的、受調(diào)節(jié)的、嵌合的啟動(dòng)子等，以允許治療產(chǎn)物在感染組織中有效和合適的生產(chǎn)。啟動(dòng)子可以是與編碼的蛋白同源或異源的，包括細(xì)胞、病毒、真菌、植物或合成啟動(dòng)子。用于本發(fā)明的最優(yōu)選的啟動(dòng)子在神經(jīng)細(xì)胞中、特別是在人細(xì)胞中、更優(yōu)選在MN中應(yīng)當(dāng)是功能性的。這種受調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子的實(shí)例包括但不限于含有Tet開/關(guān)元件的啟動(dòng)子、雷帕霉素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和金屬硫蛋白啟動(dòng)子。特異性針對MN的啟動(dòng)子的實(shí)例包括降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)的啟動(dòng)子或HB9啟動(dòng)子，所述降鈣素基因相關(guān)肽是一種已知的麗來源的因子。其他在麗中有功能的啟動(dòng)子包括膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChAT)、神經(jīng)元特異性烯醇酶(NSE)、突觸蛋白的啟動(dòng)子，或普遍存在的啟動(dòng)子，包括神經(jīng)元特異性沉默子元件(NRSE)。普遍存在的啟動(dòng)子的實(shí)例包括:病毒啟動(dòng)子，尤其是CMV啟動(dòng)子、RSV啟動(dòng)子、SV40啟動(dòng)子等；以及細(xì)胞啟動(dòng)子例如PGK (磷酸甘油酸酯激酶)啟動(dòng)子。
[0075]在特定的實(shí)施方式中，核酸可以包含允許編碼的蛋白分泌的前導(dǎo)序列。目的轉(zhuǎn)基因與編碼分泌信號肽(通常位于分泌的多肽的N-端)的序列的融合允許治療性蛋白以可以從轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞分泌的形式進(jìn)行生產(chǎn)。這種信號肽的實(shí)例包括白蛋白、葡萄糖苷酸酶、堿性蛋白酶或纖連蛋白分泌的信號肽。
[0076]根據(jù)另一個(gè)特定的實(shí)施方式，轉(zhuǎn)基因與PTD序列如Tat或VP22序列融合，從而引起或提高治療性蛋白從轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的分泌和被相鄰細(xì)胞的再攝取。
[0077]在特定的實(shí)施方式中，核酸包含可操作地連接的啟動(dòng)子和前導(dǎo)序列，以允許表達(dá)和分泌編碼的蛋白。
[0078]在另一個(gè)特定的實(shí)施方式中，核酸包含可操作地連接的啟動(dòng)子、前導(dǎo)序列和PTD序列，以允許表達(dá)和分泌編碼的蛋白。
[0079]在最優(yōu)選的實(shí)施方式中，啟動(dòng)子是普遍存在的。
[0080]同樣，也可以使用編碼超過一種治療產(chǎn)物的病毒載體。這種雙順反子或多順反子的病毒載體例如可編碼:SMN(或促進(jìn)SMN水平增加的任何序列)，以及所編碼的因子促進(jìn)對治療的疾病而言具有治療重要性的另一種功能例如細(xì)胞存活(例如，抗凋亡或神經(jīng)營養(yǎng)因子)、軸突生長或維持(例如神經(jīng)營養(yǎng)因子，轉(zhuǎn)化生長因子或細(xì)胞外基質(zhì)組分)的序列，或?qū)趋兰』蛐募?例如肌肉營養(yǎng)因子，肌生成的活化劑)賦予有益效果的任何序列。
[0081]如上所討論的，AAV載體可通過本領(lǐng)域中本身已知的技術(shù)來生產(chǎn)，如在實(shí)施例中進(jìn)一步示出的。
[0082]腦脊液和血液聯(lián)合施用
[0083]本發(fā)明特別基于以下出乎意料的發(fā)現(xiàn):當(dāng)使用可轉(zhuǎn)移的病毒載體并將其遞送到對象的血液和腦脊液(CSF)兩者中時(shí)，可以獲得提高的病毒介導(dǎo)的基因表達(dá)和疾病矯正。令人驚訝地，結(jié)果顯示，與在一個(gè)單一施用位點(diǎn)中相同劑量的病毒相比，這樣的聯(lián)合施用導(dǎo)致顯著增加的治療基因表達(dá)。本發(fā)明進(jìn)一步顯示，聯(lián)合施用提高了治療對象中的治療益處，例如顯著提高存活和重量增加并恢復(fù)生殖能力。
[0084]在本發(fā)明的上下文中，血液施用指將載體直接外周施用到血流或周圍組織中。這樣的施用包括但不限于全身注射例如靜脈內(nèi)(1.v.)、肌內(nèi)(1.m.)、腹膜內(nèi)(1.p.)、動(dòng)脈內(nèi)、皮下或經(jīng)皮注射。最優(yōu)選的血液施用包括1.V.、1.a.、或s.c.注射。
[0085]用于血液遞送的其他(盡管較不優(yōu)選)途徑包括皮內(nèi)注射、經(jīng)鼻遞送、經(jīng)皮遞送(例如貼劑)、或經(jīng)腸遞送(口腔或直腸)。
[0086]可使用常規(guī)裝置和方案實(shí)現(xiàn)血液施用。例如，可使用任何可用的注射器、針、泵、手術(shù)等進(jìn)彳T注射。
[0087]在本發(fā)明的上下文中，施用到CSF中指將載體直接施用到CSF或周圍組織中，使病毒載體釋放到CSF中。腦脊液充滿腦室并包圍腦和脊髓。CSF本質(zhì)上由脈絡(luò)叢產(chǎn)生。研宄表明成人中CSF的體積為約150ml，并且每天產(chǎn)生約500ml的CSF，這與CSF被連續(xù)不斷地生產(chǎn)、循環(huán)和吸收的事實(shí)相一致。CSF最終經(jīng)由蛛網(wǎng)膜絨毛和顱內(nèi)血管竇流入血液。
[0088]通過將本發(fā)明的tAAV載體注射到CSF中，本發(fā)明人已令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，tAAV載體能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)CNS(包括腦、視網(wǎng)膜和脊髓)中的細(xì)胞以及外周系統(tǒng)(例如，外周神經(jīng)系統(tǒng)和外周器官，包括骨骼肌和心臟)中的細(xì)胞。將tAAV注射到CSF中甚至可導(dǎo)致比單獨(dú)外周施用更強(qiáng)的基因表達(dá)和臨床益處。
[0089]本發(fā)明的CSF施用具體包括1.c.V.注射、鞘內(nèi)(1.t.)注射、或腦池內(nèi)(1.c)注射。優(yōu)選的CSF施用包括ICV或IT注射。最優(yōu)選的施用包括注射在至少一個(gè)腦側(cè)室中。
[0090]在這一方面，本發(fā)明的病毒載體可通過使用任何合適的裝置例如針、注射器、套管、或?qū)Ч茏⑸涞侥X室區(qū)域中(例如，注射到填充有CSF的一個(gè)或兩個(gè)腦側(cè)室中)而被直接遞送到CSF中。這種施用可使用本領(lǐng)域本身已知的神經(jīng)外科技術(shù)來進(jìn)行(Davidson等，PNAS97:3428-3432，2000)。對于1.c.V.注射來說，注射的病毒載體溶液的總體積通常介于
0.1?5ml之間。
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