091]也可使用本領域本身已知的技術實現(xiàn)鞘內注射。在患者中1.t.注射后，AAV載體可通過腰椎穿刺進行鞘內施用，腰椎穿刺是在床邊常規(guī)進行的安全程序，其允許將病毒粒子釋放到周圍 CSF 中(Beutler AS，Curr Opin Mol Ther.20050ct ；7 (5): 431-9)。
[0092]將病毒載體具體施用到CNS的特定區(qū)域可通過立體定位微注射來完成。為此目的，可使用例如高分辨MRI生成一個或多個腦圖像，并可以將得到的圖像轉移到指導立體定位注射的計算機。如果必要，可使用公知常識來鑒定人腦內的特定結構(參見例如，人腦:表面、使用MRI的三維斷面解剖學、以及血液供應(The HumanBrain:Surface, Three-Dimens1nal Sect1nal Anatomy With MRI, and Blood Supply),第二版，Deuteron 等主編，Springer Vela，1999)。
[0093]如上所指出的，本發(fā)明在于基于向CSF和血液聯(lián)合施用的病毒介導的基因治療方法。
[0094]在本發(fā)明的上下文中，術語“聯(lián)合”施用指在足以在體內產生聯(lián)合效果而沒有顯著的免疫干擾的短時間框架內將載體施用到兩個隔室中。更優(yōu)選地，“聯(lián)合”施用包括在彼此相隔小于72小時內、優(yōu)選小于48小時內、更優(yōu)選小于24小時內、還更優(yōu)選彼此相隔小于I小時內施用到所述哺乳動物的CSF和血液中。聯(lián)合施用可以首先在CSF中進行，隨后在血液中進行，反之亦然。
[0095]在優(yōu)選的實施方式中，聯(lián)合施用是基本上同時的注射，即兩種注射基本上同時進行或一個緊接著另一個進行。
[0096]病毒載體的劑量和CSF/血液比率可由技術人員例如根據(jù)疾病狀況、對象和治療時間表進行調整。病毒載體通常以“治療有效”量施用，“治療有效”量即足以緩解(例如，降低、減輕、阻斷或矯正)至少一種與疾病狀態(tài)相關的癥狀或提供對象的狀況的改善的量。有效劑量可能是足以提高存活的劑量。通常，使用19?10 16、優(yōu)選約101°?10 15的總劑量的病毒載體(即，粒子或病毒基因組)，該總劑量被分成兩個單位劑量，分別用于CSF/血液施用。一個示例性劑量介于5xl0lcl至5x10 1Vkg之間。
[0097]在這方面，可以調整被施用在CSF中和血液中的病毒載體的相對量以提供最佳臨床益處。在這方面，本發(fā)明人已經表明，比率:被施用在CSF中的劑量/被施用在血液中的劑量應優(yōu)選地介于0.2和5之間，甚至更優(yōu)選地介于0.2和3之間。優(yōu)選的比率的具體實例為 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 或 1.25。
[0098]治療可以由單次聯(lián)合施用構成，或可以重復進行。如果重復施用，隨后的施用可以是單一(即，僅在選自CSF或血液的一個位點中)或聯(lián)合的。同樣，當進行重復施用時，優(yōu)選交替使用不同的病毒血清型。作為一個實例，可以使用AAV9載體進行首次聯(lián)合施用并且使用AAVlO載體進行第二次施用，反之亦然。
[0099]病毒載體可以以任何合適的形式進行施用:作為液體溶液或混懸液，作為適合于在注射前配制成液體溶液或混懸液的固體形式，作為凝膠或乳液，或噴霧劑。病毒載體通常與任何合適且藥學可接受的賦形劑、載體、佐劑、稀釋劑等配制在一起。對于注射來說，賦形劑可以是液體、等滲溶液、緩沖液，例如無菌且無熱原的水或者無菌且無熱原的磷酸鹽緩沖的鹽溶液。
[0100]在特定的實施方式中，本發(fā)明在于治療哺乳動物中的多系統(tǒng)疾病的方法，所述治療通過施用有效地治療所述疾病的治療基因來實現(xiàn)，其中所述治療基因被包含在AAV9或AAVlO載體中，并且其中所述方法包括以介于0.3和3之間的劑量比1.c.v./1.V.對所述載體進行1.c.V.和1.V.聯(lián)合施用。
[0101]如上所指出的，本發(fā)明可用于治療神經系統(tǒng)疾病，優(yōu)選CNS或多系統(tǒng)神經疾病。治療可用于緩解病理，特別是用于提高存活、重量、生殖能力、運動功能、麗的數(shù)量或肌肉大小。
[0102]試劑盒
[0103]本發(fā)明還涉及組合物和試劑盒。在這方面，本發(fā)明的另一目的是組合物或試劑盒，其包含兩個單位劑量的包含治療基因的可轉移的病毒載體，其中一個單位劑量適用于全身注射，一個單位劑量適合于注射到CSF中。1.c.V./全身劑量比優(yōu)選介于0.3和3之間，甚至更優(yōu)選選自 0.2,0.4,0.6,0.8,1.0、或 1.25。
[0104]本發(fā)明的試劑盒通常包含一個或多個獨立的容器，所述容器各自包含CSF和血液單位劑量。試劑盒也可包含一套說明書，一般是書面說明書，所述說明書涉及用于本文中描述的任何方法的載體的使用。試劑盒還可包含適合于單位劑量的施用的裝置或部件，例如安瓿、注射器、針等。
[0105]運動神經元疾病
[0106]本發(fā)明可通過治療產物的大量和廣泛遞送而用于治療各種疾病。治療產物可以是可能緩解或減輕疾病的病因或癥狀或者以其他方式向對象賦予益處的任何蛋白、肽或RNA。治療性蛋白的實例包括生長因子、細胞因子、激素、神經遞質、酶、抗凋亡因子、血管生成因子、以及已知在病理疾病中突變的任何蛋白例如“運動神經元存活”蛋白(SMN)。治療性RNA的實例包括靶向信使RNA的反義RNA或RNAi，所述信使RNA編碼在下文提到的任何疾病中具有治療重要性的蛋白。例如，在ALS的治療方面，靶向超氧化物歧化酶的RNAi可由如上定義的AAV載體編碼。
[0107]下面提供了優(yōu)選的候選治療產物的列表:
[0108]SMN(SMA)
[0109]IGHMBP2(SMA-RD)
[0110]VAPB (SMA 或 ALS)
[0111]靶向SMN2的mRNA前體剪接位點的反義寡核苷酸序列(SMA)
[0112]靶向SODl的mRNA前體剪接位點的反義寡核苷酸序列(ALS)或ATX (脊髓小腦性共濟失調)或 UBQLN2(ALS)或 ATAXIN2 (ALS)或 C9orf 72 (ALS)或 TARDBP (ALS)或 TDP-43，F(xiàn)US， (ALS 和 FTD)
[0113]靶向SODl的mRNA的shRNA (微RNA或siRNA) (ALS)或ATX (脊髓小腦性共濟失調)或 UBQLN2(ALS)或 ATAXIN2 (ALS)或 C9orf72 (ALS 或額顳葉退化癥 |FTD])或 TARDBP (ALS)或 TDP-43 (ALS 和 FTD)或 FUS，(ALS 和 FTD)或 CHMP2B (ALS)
[0114]ATX (脊髓小腦性共濟失調)或 UBQLN2 (ALS)或 ATAXIN2 (ALS)或 C9orf 72 (ALS 或額顳葉退化癥 IFTD])或 TARDBP (ALS)或 TDP-43 或 FUS，(ALS 和 FTD)或 CHMP2B (ALS)
[0115]MECP2 或靶向 MECP2 的 shRNA (Rett 綜合征)
[0116]HEXB(山德霍夫病(Sandhoff disease))
[0117]根據(jù)治療產物，本發(fā)明可用于治療各種疾病，包括可通過在神經組織中表達治療性蛋白、或抑制來自于神經組織的毒性蛋白而進行治療或預防的任何疾病。這種疾病包括中樞或外周神經疾病，優(yōu)選選自神經退行性疾病、神經肌肉疾病、創(chuàng)傷、骨髓損傷、疼痛(包括神經性疼痛)、神經系統(tǒng)腫瘤、脫髓鞘性疾病、神經系統(tǒng)的自身免疫疾病、神經毒性綜合征、或多系統(tǒng)疾病例如溶酶體或過氧化物酶體疾病。
[0118]疾病的特定實例包括阿爾茨海默病、帕金森病、亨廷頓病、杜爾雷斯綜合征(Tourette Syndrome)、精神分裂癥、斯萊病(Sly disease)、亨特病、癡呆、多疑癥、強迫癥、智力遲鈍、肌萎縮性側索硬化癥、脊髓性肌萎縮、腓骨肌萎縮癥(Charcot-Marie Toothdisease)、脊髓小腦性共濟失調、痙攣性截癱、肯尼迪病、膠質母細胞瘤、神經母細胞瘤、自閉癥、高雪病(Gaucher’s disease)、粘多糖病(Hurler’s disease)、克拉伯病和行為改變(例如，睡眠、感知或認知障礙)。
[0119]本發(fā)明可用于任何哺乳動物，特別是人類對象，包括成人，以進行預防性或治療性治療。
[0120]在以下實驗部分中將公開本發(fā)明的其他方面和優(yōu)點，所述實驗部分應僅視為說明性的并且不限制本申請的范圍。
實施例
[0121]材料和方法
[0122]動物
[0123]SMNA 7小鼠(被認為是I型SMA的模型)購自Jackson實驗室(SMN2+/+，SMNΔ 7+/+, Smn-/-, JACKSON n0.SN 5025)。這些小鼠是三重突變體，通過外顯子2的靶向突變而使內源性鼠Smn基因失效，并帶有兩種轉基因的等位基因(人SMN2cDNA[缺少外顯子7]和整個人SMN2基因)(Le T.T.Hum Mol Genet 2005)。野生型小鼠(WT)對應于[SMN2+/+，SMNA 7+/+，Smn+/+]同窩出生者，并且雜合小鼠(Ht)對應于[SMN2+/+，SMN Δ 7+/+，Smn+/-]同窩出生者。喂養(yǎng)小鼠以產生自立的群體并且將它們維持在受控的條件下(22土1°C，60±10%相對濕度，12h/12h光/黑循環(huán)，食物和水隨意)。根據(jù)關于實驗動物護理和使用的歐洲指南進行所有的動物實驗。
[0124]scAAV載體的生產
[0125]如之前所述(Duqu6等，Mol Ther 2009 ；Dominguez 等，Hum Mol Genet 2011)并加以輕微的修改，使用AAV2質粒生產相應的假型AAV9載體，所述AAV2質粒在CMV啟動子的控制下表達GFP轉基因，或在磷酸甘油酸酯激酶(PGK)啟動子的控制下表達hSMNl的密碼子優(yōu)化的序列(SMNopti)。簡單地說，使用(i)腺病毒輔助質粒、(ii)編碼rep2和cap9基因的AAV包裝質粒(p5E18-VD2/9)和表達GFP或SMNopti的AAV2質粒，通過在HEK293細胞中進行無輔助病毒的三質粒轉染來生產AAV9-SMN。通過在碘克沙醇密度梯度上超速離心來純化重組載體。使用Amicon Ultra一Ultra cell 10K過濾器單元(Millipore)對病毒制備物進行脫鹽和濃縮。將等分試樣儲存在_80°C直到使用。載體滴度通過實時PCR確定并表示為每毫升的病毒基因組(vg/ml)。
[0126]體內AAV注射
[0127]新生小鼠:
[0128]以靠近眼睛的顳靜脈的血流方向，使用具有33G針的Hamilton注射器進行1.V.注射。使用具有33G針的Hamilton注射器，在后囟點前部1mm，側向Imm和深2mm處進行1.c.V.注射。IV和ICV注射兩者均使用藍色染料溶液進行驗證。
[0129]新生的SMNA7小鼠或對照野生型同窩出生者在出生日(PO)用病毒溶液進行注射。對于單一 1.c.V注射來說，將AAV9-GFP (每只小鼠1.7 X 1elOvg, 7 μ I)或AAV9-SMNopti (每只小鼠4.5X 1elOvg, 7 μ I)單側地注射到右側室中。對于單一 1.V.注射來說，將相同濃度的載體以70 μ I的體積(在PBS中)注射到顳靜脈中。對于1.V.和1.c.V.聯(lián)合注射來說，將2.5xl0el0vg(30 μ I)的AAV9_SMNopti注射到顳靜脈中并且將2xl0el0vg(3 μ I)的AAV9_SMNopti單側地注射到右側室中。
[0130]新生的Smn-/-SMN2+/+小鼠和野生型對照同窩出生者在出生時用相似的程序進行注射。對于AAV9-GFP和AAV9-SMNopti的單一 1.c.v注射來說，載體劑量和體積與用于新生的SMNA 7小鼠的載體劑量和體積相同。對于1.v.注射來說，將AAV9-GFP(每只小鼠 1.2X 1ellvg)或 AAV9_SMNopti (每只小鼠 3.4X 1ellvg)以 50 μ I 的體積(在 PBS中)注射到顳靜脈中。對于1.v.和1.c.v.聯(lián)合注射來說，將4.5xl0el0vg(50 μ I)的AAV9-SMNopti注射到顳靜脈中并且將4.5xl0el0vg(7 μ I)的AAV9_SMNopti單側地注射到左側室中。
[0131]成年小鼠.一月齡的野生型小鼠(η = 4)用 scAAV9-GFP (4.8 X 1elOvg, 20 μ I)注射到右側室中。在腹膜內麻醉(氯胺酮(100mg/Kg)，甲苯噻嘆(10mg/kg))下進行注射。直接在左腦室中進行立體定位注射(在前鹵后部0.34mm，側向1.0mm和距腦頂深1.8mm)。
[0132]組織學
[0133]在注射后15天和I個月時將小鼠安樂死以分別進行SMN和GFP表達分析。將小鼠麻醉(10mg/kg甲苯噻嗪，100mg/kg氯胺酮)并用0.l