一種基于納米金的分子信標(biāo)及其制備與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于納米金的多色分子信標(biāo)及其制備與 應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 1996年Tyagi和Kramer報(bào)道了一種具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的新型熒光核酸探針--分子 信標(biāo)（molecular beacon)，最初目的是能在液相中定量測(cè)定革El標(biāo)的量。自由狀態(tài)時(shí)的分 子信標(biāo)呈發(fā)夾結(jié)構(gòu)，此時(shí)由于熒光基團(tuán)與猝滅基團(tuán)靠得很近，熒光被猝滅；當(dāng)與靶序列結(jié)合 后，分子信標(biāo)的空間構(gòu)型發(fā)生改變，熒光恢復(fù)。分子信標(biāo)技術(shù)以其操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、特異 性強(qiáng)、可對(duì)核酸進(jìn)行實(shí)時(shí)定量測(cè)定、甚至可以用于活體分析等特點(diǎn)不僅在生物學(xué)研宄中有 著廣泛的應(yīng)用，而且在疾病基因檢測(cè)與診斷等生物醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)和臨床研宄中也將充當(dāng)重要的 角色。近來，人們通過改變經(jīng)典分子信標(biāo)的結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)出許多新型的分子信標(biāo)，如用ssDNA 鏈做環(huán)、用RNA-DNA雙鏈做莖的RNA-DNA嵌合型分子信標(biāo)，用PNA鏈代替ssDNA形成的PNA 分子信標(biāo)等。新型分子信標(biāo)的出現(xiàn)為分子信標(biāo)的進(jìn)一步應(yīng)用拓寬了領(lǐng)域。
[0003] 分子信標(biāo)的設(shè)計(jì)一般包括三個(gè)部分：
[0004] (1)環(huán)狀區(qū)：一般為長(zhǎng)度15~30堿基的序列，能與目標(biāo)分子特異結(jié)合；
[0005] (2)信標(biāo)莖干區(qū)：通常為長(zhǎng)度5~8個(gè)堿基的互補(bǔ)序列，莖干區(qū)與雜交后環(huán)狀 區(qū)-目標(biāo)分子的雙鏈結(jié)構(gòu)之間的熱力學(xué)平衡關(guān)系，使分子信標(biāo)的雜交特異性明顯高于常規(guī) 的線狀探針；
[0006] (3)熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)，熒光基團(tuán)一般聯(lián)接在信標(biāo)分子的5端；猝滅基團(tuán)聯(lián)接在 3'端。圖1為經(jīng)典的分子信標(biāo)結(jié)構(gòu)，其中1-氨基萘-8-羧酸（EDANS)為熒光素，二甲氨基 偶氮苯甲酰（DABSYL)為猝滅劑。分子信標(biāo)中常用4-(4' -二甲基氨基偶氮苯基）苯甲酸 (DABCYL)作為猝滅基團(tuán)，德克薩斯紅（TexasRed)、熒光素（Fluoresein)等作為熒光基團(tuán)。
[0007] 自由狀態(tài)時(shí)，發(fā)夾結(jié)構(gòu)的兩個(gè)末端靠近，使焚光分子與猝滅分子靠近（約為 7-10nm)。此時(shí)發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，使熒光分子發(fā)出的熒光被猝滅分子吸收并以熱的 形式散發(fā)，熒光幾乎完全被猝滅，熒光本底極低。圖2為分子信標(biāo)的工作原理，當(dāng)分子信標(biāo) 與序列完全互補(bǔ)的祀標(biāo)分子結(jié)合形成雙鏈雜交體時(shí)，信標(biāo)莖桿互補(bǔ)區(qū)被拉開，焚光分子和 猝滅分子距離增大。根據(jù)Foerster理論，中心熒光能量轉(zhuǎn)移效率與兩者距離的6次方成 反比。雜交后，信標(biāo)分子的熒光幾乎100%恢復(fù)。且所檢測(cè)到的熒光強(qiáng)度與溶液中靶標(biāo)的 量成正比。分子信標(biāo)中最常用的猝滅劑是DABSYL，它對(duì)多種熒光素都有較強(qiáng)的熒光猝滅效 率。近來Dubertret等用金納米粒子簇代替DABSYL做猝滅劑，人們還可以通過調(diào)節(jié)金屬納 米簇的形狀、大小和組成而得到不同的猝滅劑。由于金納米簇對(duì)熒光試劑有著更高的猝滅 效率，所以用金納米粒子代替DABSYL后，大大提高了分子信標(biāo)的靈敏度和特異性。Demidov 等人設(shè)計(jì)出DNA或PM無莖分子信標(biāo)，與經(jīng)典分子信標(biāo)結(jié)構(gòu)類似，只是不再含有雙鏈結(jié)構(gòu)的 莖桿區(qū)。由于DNA戊糖骨架或PNA聚酰胺骨架具有很好的柔韌性，在無靶標(biāo)存在的情況下， 熒光分子與猝滅分子間的疏水作用使得無莖分子信標(biāo)近似于一個(gè)閉環(huán)結(jié)構(gòu)。當(dāng)分子信標(biāo)與 靶標(biāo)結(jié)合后，探針和靶標(biāo)形成的雙鏈具有剛性結(jié)構(gòu)使熒光分子和猝滅分子分開，熒光恢復(fù)。 無莖分子信標(biāo)與經(jīng)典的分子信標(biāo)相比，它的優(yōu)點(diǎn)在于無莖分子信標(biāo)不含有與靶標(biāo)無關(guān)的序 列，但缺點(diǎn)是自由狀態(tài)時(shí)，無莖分子信標(biāo)的熒光本底較高。
[0008] 現(xiàn)有的檢測(cè)miRNA的方法已有多種。如Northern blotting方法是一種直接檢測(cè) 的方法，不需要對(duì)miRNA樣本進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增，其原理是首用聚丙烯酰胺電泳分離出小的RNA， 經(jīng)洗膜、顯影后對(duì)條帶進(jìn)行分析。雖然Northern bolt是當(dāng)前miRNA分析的標(biāo)準(zhǔn)方法，但其 操作繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)、靈敏度低和所需樣品量過多，且對(duì)RNase污染非常敏感。微列陣芯片是 實(shí)現(xiàn)miRNA表達(dá)譜分析和多種miRNA同時(shí)高通量檢測(cè)的主要技術(shù)，該方法的優(yōu)越性在于可 實(shí)現(xiàn)高通量多組分同時(shí)檢測(cè)，但微陣列芯片的制作成本和檢測(cè)費(fèi)用很高，芯片上可利用的 樣品體積很小，因而導(dǎo)致靈敏度不高，獲得數(shù)據(jù)偏差較大。原位雜交是利用比色或熒光試劑 等標(biāo)記的核酸探針與組織或細(xì)胞中的miRNA進(jìn)行雜交，通過焚光成像或顯色來檢測(cè)miRNA 的表達(dá)情況，可直觀地展現(xiàn)miRNA的時(shí)空表達(dá)模式，此方法成功應(yīng)用于多種組織和細(xì)胞內(nèi) miRNA原位分析，也提高了 miRNA的檢測(cè)靈敏度。然而由于miRNA序列較短，原位雜交技術(shù) 需進(jìn)一步提高雜交的親和性，避免miRNA在雜交過程和洗脫過程中丟失。滾環(huán)擴(kuò)增法模仿 生物體喚醒DNA分子滾環(huán)式復(fù)制的方式，以循環(huán)實(shí)現(xiàn)DNA的連續(xù)擴(kuò)增。但以miRNA為模板 連接探針成環(huán)的特異性較差且效率低，需要通過電泳分離后利用放射性同位素檢測(cè)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 鑒于以上所述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，本發(fā)明的目的在于提供一種基于納米金的分子信 標(biāo)及其制備與應(yīng)用。
[0010] 本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0011] 本發(fā)明的第一方面提供了一種基于納米金的分子信標(biāo)，包括依次排布的熒光基 團(tuán)、第一信標(biāo)莖干區(qū)、環(huán)狀區(qū)、第二信標(biāo)莖干區(qū)和納米金，所述環(huán)狀區(qū)為與待測(cè)目標(biāo)分子特 異結(jié)合的核苷酸片段，所述第一信標(biāo)莖干區(qū)的核苷酸序列與第二信標(biāo)莖干區(qū)的核苷酸序列 互補(bǔ)。
[0012] 優(yōu)選地，所述納米金通過PolyA與第二信標(biāo)莖干區(qū)連接。
[0013] PolyA，亦即，多聚腺苷酸，為多個(gè)連續(xù)的腺苷酸A組成的核苷酸片段。
[0014] 優(yōu)選采用 PolyA20 或 PolyAlO。
[0015] 所述PolyA20的核苷酸序列如SEQID NO. 18所示，具體為：
[0016] AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA 〇
[0017] 所述PolyAlO的核苷酸序列如SEQID NO. 19所示，具體為：
[0018] AAAAAAAAAAo
[0019] 更優(yōu)選采用PolyA20。
[0020] 優(yōu)選地，所述環(huán)狀區(qū)為含有15~30個(gè)堿基的核苷酸片段。所述環(huán)狀區(qū)能與待測(cè) 目標(biāo)分子特異結(jié)合，所述環(huán)狀區(qū)可以根據(jù)待測(cè)目標(biāo)分子的核苷酸序列來設(shè)計(jì)。
[0021] 優(yōu)選地，所述第一信標(biāo)莖干區(qū)和第二信標(biāo)莖干區(qū)均為含有5~8個(gè)堿基的核苷酸 片段。
[0022] 所述第一信標(biāo)莖干區(qū)的核苷酸序列與第二信標(biāo)莖干區(qū)的核苷酸序列互補(bǔ)。
[0023] 優(yōu)選地，所述分子信標(biāo)的5'端連接熒光基團(tuán)，3'端連接納米金。
[0024] 優(yōu)選地，所述熒光基團(tuán)的激發(fā)波長(zhǎng)與所述納米金的發(fā)射波長(zhǎng)有部分重疊。更優(yōu)選 地，所述熒光基團(tuán)選自FAM、ROX、Cy3或Cy5。
[0025] 優(yōu)選地，所述納米金的粒徑為13~15nm。所述納米金為現(xiàn)有技術(shù)，既可以參考現(xiàn) 有的文獻(xiàn)制備，也可以通過商業(yè)途徑購買。
[0026] 優(yōu)選地，所述環(huán)狀區(qū)的核苷酸序列以及任一信標(biāo)莖干區(qū)的核苷酸序列均與待測(cè)目 標(biāo)分子的靶核苷酸序列互補(bǔ)。
[0027] 自由狀態(tài)時(shí)，分子信標(biāo)的兩個(gè)末端靠近，使焚光基團(tuán)與納米金靠近，此時(shí)發(fā)生焚光 共振能量轉(zhuǎn)移效應(yīng)。當(dāng)分子信標(biāo)與序列完全互補(bǔ)的待測(cè)目標(biāo)分子結(jié)合形成雙鏈雜交體時(shí)， 信標(biāo)莖桿互補(bǔ)區(qū)被拉開，熒光基團(tuán)和納米金距離增大，熒光共振能量轉(zhuǎn)移效應(yīng)減弱甚至消 失。從而根據(jù)熒光強(qiáng)度變化來檢測(cè)目標(biāo)分子的含量。
[0028] 本發(fā)明的第二方面還提供了一種制備前述基于納米金的分子信標(biāo)的方法，所述方 法包括如下步驟：
[0029] (1)將由依次首尾連接的熒光基團(tuán)、第一信標(biāo)莖干區(qū)、環(huán)狀區(qū)、第二信標(biāo)莖干區(qū)和 PolyA組成的熒光探針與納米金混合；
[0030] (2)在步驟⑴中所得混合液中，加入PolyA5 ;
[0031] (3)調(diào)節(jié)PH至中性，離心，洗絳，重懸于雜交液，備用即可。
[0032] 優(yōu)選地，所述PolyA5的核苷酸序列如如SEQID NO. 20所示，具體為：AAAAA。
[0033] 優(yōu)選地，所述熒光探針、納米金以及PolyA5三者之間的摩爾比例為：（200~800): 1 : (100 ~400) 〇
[0034] 更優(yōu)選地，三者之間的摩爾比例為：300 :1 :100。
[0035] 優(yōu)選地，所述熒光探針的濃度為：50uM~lOOuM。更優(yōu)選地，所述熒光探針的濃度 為 100uM。
[0036] 優(yōu)選地，所述納米金的濃度為3nM~10nM。更優(yōu)選地，所述納米金的濃度為3nM。
[0037] 優(yōu)選地，所述PolyA5的濃度為50uM~100uM。更優(yōu)選地，所述PolyA5的濃度為 IOOuM0
[0038] 優(yōu)選地，調(diào)節(jié)PH時(shí)，采用0. 2M的PB溶液。
[0039] 優(yōu)選地，所述離心的速度為12000rpm，時(shí)間為20~30min。
[0040] 優(yōu)選地，洗滌時(shí)采用0.1 M的PB溶液。
[0041] 優(yōu)選地，雜交液采用0.1 M的PBS溶液。
[0042] 本發(fā)明的第三方面公開了一種非疾病診斷目的的檢測(cè)目標(biāo)分子的方法，包括如下 步驟：先將待測(cè)目標(biāo)分子和前述基于納米金的分子信標(biāo)混合，再進(jìn)行熒光值檢測(cè)。
[0043] 優(yōu)選地，所述目標(biāo)分子包括DNA、miRNA、mRNA。
[0044] 優(yōu)選地，所述前述基于納米金的分子信標(biāo)如上所述。
[0045] 本發(fā)明第四方面還提供了前述基于納米金的分子信標(biāo)在制備DNA、miRNA或mRNA 檢測(cè)試劑中的應(yīng)用。
[0046] 本發(fā)明第五方面，提供了一種試劑盒，包括前述基于納米金的分子信標(biāo)。
[0047] 本發(fā)明檢測(cè)原理如圖1所示：
[0048] 利用大粒徑的納米金顆粒（15nm)作為猝滅基團(tuán)，通過PolyA連接多種帶有不同焚 光基團(tuán)的DNA探針。當(dāng)沒有靶標(biāo)存在時(shí)，分子探針自身堿基互補(bǔ)配對(duì)，熒光基團(tuán)的熒光被淬 滅基團(tuán)淬滅。當(dāng)有靶標(biāo)存在時(shí)，靶標(biāo)與分子探針互補(bǔ)配對(duì)，熒光基團(tuán)發(fā)出熒光，通過檢測(cè)熒 光信號(hào)，實(shí)現(xiàn)檢測(cè)。
[0049] 本發(fā)明的技術(shù)關(guān)鍵點(diǎn)在于，用PolyA連接納米金及熒光探針，避免了以往用巰基 連接，合成復(fù)雜，成本高。且用PolyA連接方法簡(jiǎn)單