，納米金表面探針數(shù)量可調(diào)控，探針能保 持直立構(gòu)象，利于后續(xù)雜交。
[0050] 本發(fā)明的有益效果為：
[0051] (1)分子信標探針設(shè)計：傳統(tǒng)的分子信標設(shè)計方案，通常是分子信標的環(huán)狀部位 與靶基因互補配對，實現(xiàn)雜交。但針對納米金連接的分子信標而言，該種雜交方式雜交效率 差。故在設(shè)計分子信標序列時，讓莖部的部分序列也與靶基因互補配對，既保持了分子信標 的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，又保證檢測的特異性，提高雜交效率。
[0052] (2)分子信標探針與納米金的偶聯(lián)：在偶聯(lián)過程中，由于DNA沒有完全覆蓋納米金 表面，使得納米金在鹽溶液中極易聚沉變色，故應(yīng)確定組裝條件，避免納米金聚沉。在傳統(tǒng) 的DNA-AuNPs偶聯(lián)物制備方法中，通常需要將DNA作特殊修飾，如巰基（-SH)修飾，然后再 Au-S鍵的作用下，將DNA組裝到AuNPs表面。但這樣的偶聯(lián)方法，成本太高。同時研宄發(fā) 現(xiàn)：通過SH修飾的納米金探針，在雜交效率和雜交動力學上表現(xiàn)不佳。在制備三明治結(jié)構(gòu) 的納米金探針時，往往就需要過夜雜交。故本發(fā)明合成一段多聚A(p 〇ly A)的DNA序列，首 次實現(xiàn)了免標記DNA序列在納米金表面的組裝。該方法更簡單，成本更低。同時，還具有SH 組裝無法達到的效果：組裝密度可控，雜交效率及動力學提高。
[0053] (3)本發(fā)明以納米金為分子信標淬滅基團，可連接帶有不同熒光基團的探針組 裝成多色納米分子信標，用于同時檢測多種目標分子。方法簡單，且納米金與熒光探針用 PolyA連接，合成成本大大降低。
【附圖說明】
[0054] 圖1:本發(fā)明檢測原理圖。
[0055] 圖2 :本發(fā)明實施例1制備的納米金表征圖。
[0056] 圖3 :對實施例2形成的分子信標與待測目標分子miR155進行雜交前后的焚光 進行檢測，獲得對應(yīng)的熒光圖譜：由上到下，上面一條曲線為分子信標未與待測目標分子 miR155進行雜交時的焚光曲線，下面一條曲線為分子信標未與待測目標分子miR155進行 雜交后的熒光曲線，可以發(fā)現(xiàn)，雜交后的熒光曲線反而比雜交前的熒光曲線熒光值低，說明 采用短的T序列和PolyA連接納米金和熒光探針這種方式不成功。
[0057] 圖4 :對形成的分子信標3-1和3-2進行紫外檢測，獲得對應(yīng)的紫外圖譜，由上 到下，最上面一條為單純的AuNPs紫外曲線；中間一條為PolyA20+Au形成的分子信標 3-2的紫外曲線，最高峰值A(chǔ)523 = 0.412,分子信標3-2的濃度為1.53nM;最下面一條為 PolyAlO+Au形成的分子信標3-1的紫外曲線，最高峰值A(chǔ)523 = 0. 385,分子信標3-1的濃 度為 I. 43nM。
[0058] 圖5 :分子信標3-1所對應(yīng)焚光探針的標準曲線。
[0059] 圖6 :分子信標3-2所對應(yīng)焚光探針的標準曲線。
[0060] 圖7 :分子信標3-1所對應(yīng)熒光探針以及分子信標3-1經(jīng)MCH取代后所獲得的熒 光曲線圖，從上到下，第一條曲線表示濃度為IOOuM的熒光探針所對應(yīng)的熒光曲線；第二條 曲線表示濃度為80uM的熒光探針所對應(yīng)的熒光曲線；第三條曲線表示濃度為60uM的熒光 探針所對應(yīng)的熒光曲線；第四條曲線表示濃度為40uM的熒光探針所對應(yīng)的熒光曲線；第 五條曲線表示經(jīng)MCH取代后分子信標3-1上連接的熒光探針所對應(yīng)的熒光曲線，其最高峰 (520nm處）對應(yīng)的熒光值為1873593 ;第六條曲線表示濃度為20uM的熒光探針所對應(yīng)的熒 光曲線；第七條曲線表示濃度為IOuM的熒光探針所對應(yīng)的熒光曲線。
[0061] 圖8 :分子信標3-2所對應(yīng)熒光探針以及分子信標3-2經(jīng)MCH取代后所獲得的熒 光曲線圖，由上到下，第一條曲線表示濃度為IOOuM的熒光探針所對應(yīng)的熒光曲線；第二條 曲線表示濃度為80uM的熒光探針所對應(yīng)的熒光曲線；第三條曲線表示濃度為60uM的熒光 探針所對應(yīng)的熒光曲線；第四條曲線表示濃度為40uM的熒光探針所對應(yīng)的熒光曲線；第 五條曲線表示經(jīng)MCH取代后分子信標3-2上連接的熒光探針所對應(yīng)的熒光曲線，其最高峰 (520nm處）對應(yīng)的熒光值為1425361. 5 ;第六條曲線表示濃度為20uM的熒光探針所對應(yīng)的 熒光曲線；第七條曲線表示濃度為IOuM的熒光探針所對應(yīng)的熒光曲線。
[0062] 圖9 :對分子信標3-1和分子信標3-2分別與待測目標分子miR155進行雜交后進 行熒光檢測，獲得對應(yīng)的熒光圖譜，由上到下，第一條曲線表示分子信標3-1與miR155雜交 后所得的熒光曲線，第二條曲線表示分子信標3-2與miR155雜交后所得的熒光曲線。說明： 兩條曲線均已扣除了未雜交時的背景熒光值。可以看出，連有P〇lyA20的分子信標3-2熒 光值更高。
[0063] 圖10 :新設(shè)計的分子信標4-1與案例3中分子信標3-2的焚光圖譜進行比較，由上 到下，第一條曲線是分子信標4-1與miR155進行雜交所得的熒光曲線；第二條曲線是分子 信標3-2與miR155進行雜交所得的熒光曲線。說明：待測靶miRNA 155濃度均用200nM， 兩條曲線均已扣除未雜交時背景熒光值?？梢钥闯?，新改良后的分子信標4-1熒光值明顯 升高（大約2倍）。證明新設(shè)計的分子信標4-1探針有效。
[0064] 圖11 :由上到下，第一條曲線代表快速組裝調(diào)PH法所制備的分子信標與待測目標 分子miR155雜交后所得的熒光圖普，第二條曲線表示加鹽老化法所制備的分子信標與待 測目標分子miR155雜交后所得的熒光圖譜。
[0065] 圖12 :圖a)表示原始分子信標3-2即只有環(huán)部序列與靶序列雜交，以及改進后 的分子信標4-1即莖環(huán)部同時與靶序列雜交所得的熒光圖；b)表示沒有A5共組裝獲得的 4-1，及有A5共組裝獲得的4-2的熒光值。
[0066] 圖13 :對分子信標ΜΒ-1、ΜΒ-2、ΜΒ-3進行TEM表征，可看出連接了熒光探針的 AuNPs顆粒分散性良好，大小均一，說明連接熒光探針與納米金顆粒連接成功。
[0067] 圖14 :對分子信標MB-1、MB-2、MB-3進行紫外表征，其中，曲線1表示未連接熒光 探針前的AuNPs顆粒紫外圖譜（最大吸收峰518nm)，曲線2表示連接熒光探針形成了分子 信標后的紫外圖譜（紅移至525nm);可以看出兩條線稍有紅移，證明AuNPs顆粒與熒光探 針連接成功。
[0068] 圖15 :圖a)為分子信標MB-I焚光探針標準曲線；圖b)為分子信標MB-2焚光探 針標準曲線；圖c)為分子信標MB-3熒光探針標準曲線。
[0069] 圖16 :圖a)中，曲線1表不分子信標MB-I與Target DNAl雜交后的焚光曲線；曲 線2表不分子信標MB-I與Target DNA 1'雜交后的焚光曲線；曲線3表不未與任何物質(zhì) 雜交的分子信標MB-I自身的本底熒光曲線；圖b)中，曲線1表示分子信標MB-2與Target DNA2雜交后的熒光曲線；曲線2表示分子信標MB-2與Target DNA 2'雜交后的熒光曲線； 曲線3表示未與任何物質(zhì)雜交的分子信標MB-2自身的本底熒光曲線；圖c)中，曲線1表 不分子信標MB-3與Target DNA3雜交后的焚光曲線；曲線2表不分子信標MB-3與Target DNA 3'雜交后的熒光曲線；曲線3表示未與任何物質(zhì)雜交的分子信標MB-3自身的本底熒 光曲線。
[0070] 圖17 :為米用分子信標檢測不同濃度革巴miR ΝΑ(0, 0· 01，0· 05, 0· 1，0· 5, 1，10, 50, 100, 150 及 200nM)所對應(yīng)的熒光值；圖 a)為采用分子 信標MB-I檢測Target miRNAl (miRNA155 segment)所得熒光曲線圖；圖b)為采用分子信 標MB-2檢測Target miRNA2(miRNA196a segment)所得熒光曲線圖；圖c)為采用分子信標 MB-3 檢測 Target miRNA3(miRNA210 segment)所得焚光曲線圖。
【具體實施方式】
[0071] 在進一步描述本發(fā)明【具體實施方式】之前，應(yīng)理解，本發(fā)明的保護范圍不局限于下 述特定的具體實施方案；還應(yīng)當理解，本發(fā)明實施例中使用的術(shù)語是為了描述特定的具體 實施方案，而不是為了限制本發(fā)明的保護范圍。
[0072] 當實施例給出數(shù)值范圍時，應(yīng)理解，除非本發(fā)明另有說明，每個數(shù)值范圍的兩個端 點以及兩個端點之間任何一個數(shù)值均可選用。除非另外定義，本發(fā)明中使用的所有技術(shù)和 科學術(shù)語與本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的意義相同。除實施例中使用的具體方法、設(shè)備、 材料外，根據(jù)本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員對現(xiàn)有技術(shù)的掌握及本發(fā)明的記載，還可以使用與本 發(fā)明實施例中所述的方法、設(shè)備、材料相似或等同的現(xiàn)有技術(shù)的任何方法、設(shè)備和材料來實 現(xiàn)本發(fā)明。
[0073] 除非另外說明，本發(fā)明中所公開的實驗方法、檢測方法、制備方法均采用本技術(shù) 領(lǐng)域常規(guī)的分子生物學、生物化學、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和分析、分析化學、細胞培養(yǎng)、重組DNA技 術(shù)及相關(guān)領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。這些技術(shù)在現(xiàn)有文獻中已有完善說明，具體可參見Sambrook 等 MOLECULAR CLONING :A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989 and Third edition，2001;Ausubel 等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John ffiley&Sons, New York,1987 and periodic updates； the series METHODS IN ENZYM0L0GY, Academic Press, San Diego ；ffolffe, CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION, Third edition, Academic Press, San Diego,1998 ；METH0DS IN ENZYM0L0GY, Vol. 304, Chromatin(P. M. Wassarman and A. P. ffolffe, eds.), Academic Press，San Diego，1999;和 METHODS IN MOLECULAR BI0L0GY，Vol.119, Chr