白蛋白變體的制作方法
【專利說明】白蛋白變體
[0001 ] 序列表的引用
[0002] 本申請含有一個計算機(jī)可讀形式的序列表，該序列表通過引用結(jié)合在此。
[0003] 發(fā)明背景 發(fā)明領(lǐng)域
[0004] 本發(fā)明涉及白蛋白變體或其片段或者包含變體白蛋白或其片段的融合多肽，它們 與白蛋白、其片段或包含白蛋白或其片段的融合多肽相比，具有在對FcRn的結(jié)合親和力方 面的改變和/或在半衰期方面的改變。本發(fā)明允許根據(jù)用戶或應(yīng)用的要求和愿望定制白蛋 白的結(jié)合親和力和/或半衰期。
[0005] 相關(guān)技術(shù)說明
[0006] 白蛋白是一種在哺乳動物血漿中天然發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)，它是血漿中最豐富的蛋白 質(zhì)。它在維持所希望的血液滲透壓方面具有重要作用，并且在血流中的各種物質(zhì)的運(yùn)輸中 也具有重要作用。白蛋白已經(jīng)從包括人類、豬、小鼠、大鼠、兔、以及山羊的許多物種中得以 表征，并且它們享有高度的序列和結(jié)構(gòu)同源性。
[0007] 白蛋白體內(nèi)結(jié)合至它的受體，即新生兒Fc受體（FcRn) "布蘭貝爾（Brambell) "， 并且已知這種相互作用對于白蛋白的血漿半衰期是重要的。FcRn是一種膜結(jié)合蛋白， 被表達(dá)在許多細(xì)胞和組織類型中。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)FcRn可回收來自細(xì)胞內(nèi)降解的白蛋白（羅 帕寧（Roopenian)D.C.和阿基里奇（Akilesh)，S. (2007)，《自然綜述免疫學(xué)》（似丨·!^^ Immunol) 7, 715-725.) JcRn是一種雙功能分子，有助于維持哺乳動物如人類的血漿中高水 平的IgG和白蛋白。
[0008] 而FcRn-免疫球蛋白（IgG)相互作用已經(jīng)得以在現(xiàn)有技術(shù)中表征，F(xiàn)cRn-白蛋 白相互作用沒有被較好地表征。主要的FcRn結(jié)合位點位于DIII內(nèi)（381-585)，（安徒生 (Andersen)等人（2010)，《臨床生物化學(xué)》（Clinical Biochemistry)43, 367-372)。多個 關(guān)鍵氨基酸已經(jīng)顯示在結(jié)合中是重要的，尤其是組氨酸H464、H510和H536以及Lys500 (安 徒生等人（2010)，《自然通訊》（Nat. Commun. )3:610. DOI: 10. 1038/ncommsl607)。數(shù)據(jù)指 示IgG和白蛋白非協(xié)作式地結(jié)合至FcRn上的相異位點（安徒生等人（2006)，《歐洲免疫 學(xué)雜志》（Eur.J. Immunol)36, 3044-3051 ;喬杜里（Chaudhury)等人（2006)，《生物化學(xué)》 (Biochemistry)45, 4983-4990.)。
[0009] 已知的是FcRn結(jié)合來自小鼠和人類的IgG，然而人類FcRn顯現(xiàn)是更有差別的（奧 伯（Ober)等人（2001)《國際免疫學(xué)》（Int. Immunol) 13, 1551-1559)。安徒生等人（2010) 《生物化學(xué)雜志》（Journal of Biological Chemistry) 285 (7) :4826-36描述了人類和小鼠 FcRn對于小鼠和人類各自的白蛋白的親和力（所有可能的組合）。在生理pH下觀察到來 自任一物種的白蛋白對任一受體的非結(jié)合。在酸性pH下，觀察到結(jié)合親和力的100倍的區(qū) 另IJ。在所有情況下，來自任一物種的白蛋白和IgG與兩種受體的結(jié)合是附加的。
[0010] 人血清白蛋白（HSA)已經(jīng)被良好地表征為具有585個氨基酸的多肽，它的序列可 以發(fā)現(xiàn)于彼得斯（Peters)，T.，Jr. (1996)《關(guān)于白蛋白的全部：生物化學(xué)，遺傳學(xué)與醫(yī)學(xué)應(yīng) 用》(All about Albumin:Biochemistry, Genetics and Medical, Applications)pplO,學(xué)術(shù) 出版社公司（Academic Press, Inc.)，奧蘭多（Orlando) (ISBN 0-12-552110-3)中。它對其 受體FcRn具有特征性結(jié)合，其中它在pH6. 0而不是在pH7. 4時結(jié)合。
[0011] 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)HSA的血漿半衰期是大約19天。已經(jīng)鑒定出具有更低血漿半衰期的天 然變體（皮奇（Peach)，R. J.和布倫南（Brennan)，S. 0·，（1991)《生物化學(xué)與生物物理學(xué) 報》(Biochim Biophys Acta. ) 1097:49-54)，具有取代D494N。在該變體中該取代產(chǎn)生了一 個N-糖基化位點，該位點在野生型白蛋白中是不存在的。不知道的是糖基化或氨基酸改變 是否對血漿半衰期的改變有貢獻(xiàn)。
[0012] 白蛋白具有長的血漿半衰期，并且由于此特性它已經(jīng)被建議用于藥物遞送中。已 經(jīng)將白蛋白軛合至藥學(xué)上有益的化合物（W0 2000/69902)，并且發(fā)現(xiàn)該軛合物維持白蛋白 的長的血漿半衰期。通常認(rèn)為所得的軛合物的血漿半衰期顯著長于單獨(dú)的有益治療化合物 的血衆(zhòng)半衰期。
[0013] 另外，已經(jīng)將白蛋白從遺傳學(xué)角度融合至治療有益肽中（W0 2001/79271 A和WO 2003/59934)，伴隨的典型結(jié)果是該融合物具有治療有益肽的活性以及比該單獨(dú)的治療有 益肽的血漿半衰期顯著更長的血漿半衰期。
[0014] 小田切（Otagiri)等人（2009)，《生物與制藥公報》（Biol. Pharm. Bull. )32(4),527-534披露了多于70種白蛋白變體中發(fā)現(xiàn)有25種在結(jié)構(gòu)域III中具突 變。在羧基端缺乏最后175個氨基酸的天然變體已經(jīng)顯示具有減少的半衰期（安徒生等人 (2010)，《臨床生物化學(xué)》(Clinical Biochemistry)43, 367-372)。巖夫（Iwao)等人（2007) 使用小鼠模型研宄了天然存在的人白蛋白變體的半衰期，并且發(fā)現(xiàn)K541E和K560E具有減 少的半衰期，E501K和E570K具有最佳的半衰期，并且K573E對半衰期幾乎沒有影響（巖夫 等人（2007)Β·Β·Α·《蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)組學(xué)》(Proteins and Proteomics) 1774, 1582-1590)。
[0015] 加利亞諾（Galliano)等人（1993)《生物化學(xué)與生物物理學(xué)報》（Biochim. Biophys.Acta) 1225, 27-32 披露了一種天然變體 E505K。明基奧蒂（Minchiotti)等人 (1990)披露了一種天然變體K536E。明基奧蒂等人（1987)《生物化學(xué)與生物物理學(xué)報》 (Biochim. Biophys. Acta) 916, 411-418 披露了 一種天然變體 K574N。高橋（Takahashi)等 人（1987)《美國國家科學(xué)院院刊》(Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 84, 4413-4417披露了一種天 然變體D550G?？柹–arlson)等人（1992).《美國國家科學(xué)院院刊》（Proc. Nat. Acad. Sci. USA) 89, 8225-8229 披露了一種天然變體 D550A。
[0016] WO 2011/051489 和 TO 2012/150319(PCT/EP2012/058206)披露了在白蛋白中的 多個點突變，這些點突變調(diào)節(jié)白蛋白與FcRn的結(jié)合，WO 2010/092135披露了白蛋白中的多 個點突變，這些點突變增加了可用于白蛋白軛合的硫醇的數(shù)目，該披露沒有記載關(guān)于突變 對白蛋白與FcRn的結(jié)合的影響。WO 2011/103076披露了白蛋白變體，各自包含HSA的結(jié)構(gòu) 域III中的取代。WO 2012/112188披露了包含HSA的結(jié)構(gòu)域III中的取代的白蛋白變體。
[0017] 白蛋白具有結(jié)合多個配體的能力，并且這些配體變得與白蛋白締合的（締合）。 該特性已被用來延長具有非共價結(jié)合至白蛋白的能力的藥物的血漿半衰期。這還可以通 過將具有很少或不具有白蛋白結(jié)合特性的藥學(xué)上的有益化合物結(jié)合至具有白蛋白結(jié)合特 性的部分來實現(xiàn)，參見克拉茨（Kratz) (2008)《控制釋放雜志》（Journal of Controlled Release) 132, 171-183其中的綜述文章和參考文獻(xiàn)。
[0018] 白蛋白用于藥學(xué)上的有益化合物的制劑中，其中這種制劑可以是例如但不限于白 蛋白的納米顆粒或微粒。在這些實例中，藥學(xué)上的有益化合物或化合物的混合物的遞送可 以受益于白蛋白與其受體的親和力的改變，其中已經(jīng)顯示有益化合物與白蛋白締合以便用 于遞送手段。尚不清楚的是什么決定了所形成締合物（例如但不限于Levemiru，庫爾茨斯 (Kurtzhals) P等人《生物化學(xué)雜志》（Biochem. J.) 1995 ;312:725-731)、軛合物或融合多肽 的血漿半衰期，但顯現(xiàn)出是白蛋白與所選擇的藥學(xué)上的有益化合物/多肽的組合的結(jié)果。 希望的是能夠控制給定白蛋白軛合物、締合物或白蛋白融合多肽的血漿半衰期，從而可以 實現(xiàn)與締合物、軛合物或融合物的組分給出的血漿半衰期相比更長或更短的血漿半衰期， 以便能夠根據(jù)意欲治療的適應(yīng)癥的詳情來設(shè)計具體藥物。
[0019] 已知白蛋白可在腫瘤中積聚并且發(fā)生分解代謝，還顯示白蛋白在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié) 炎患者的發(fā)炎關(guān)節(jié)中積聚。參見克拉茨（Kratz) (2008)《控制釋放雜志》（Journal of Controlled Release) 132, 171-183其中的綜述文章和參考文獻(xiàn)?？梢栽O(shè)想針對FcRn具有 增加的親和力的HSA變體對于藥學(xué)上的有益化合物的遞送將是有利的。
[0020] 甚至希望的是具有多種很少結(jié)合或不結(jié)合至FcRn的白蛋白變體，從而提供更短 的半衰期或受控制的血漿藥物代謝動力學(xué)，如由科那諾娃（Kenanova)等人（2009)《核醫(yī)學(xué) 雜志》（J. Nucl. Med.) ;50 (增刊2) : 1582)所描述的。
[0021] 科那諾娃等人（2010,《蛋白質(zhì)工程、設(shè)計與選擇》（Protein Engineering, Desig n&Selection) 23(10) :789-798 ;W0 2010/118169)披露了一種對接模型，該對接模型包括 HSA(在pH7至8溶解）結(jié)構(gòu)域III的結(jié)構(gòu)模型以及FcRn(在pH6. 4溶解）的結(jié)構(gòu)模型。 科那諾娃等人披露了潛在地與FcRn相互作用的結(jié)構(gòu)域III中的位置464、505、510、531和 535。在位置464、510和535處的組氨酸被喬杜里（Chaudhury)等人（2006,