br>[0165] 5.由900c 0002基因的異源表達進行的酶活性的確認
[0166] 將從假絲酵母菌(Candida bomb i co I a) KSM36株中提取的基閔組DNA作為樽板，伸 用引物 AOX F(5'_gaaggagatatacatatgactgacgcagttatcctc_3'）（序列號 14)、以及 AOX R( 5'_agtgcggccgcaagctagcttagtttgaagcttag_3'）（序列號 15)，用 PCR 法擴增 900c 0002 基 因的DNA片段。另外，將質(zhì)粒pET21a (Novagen公司制造）作為模板，并使用引物pET21F (5'-gcttgcggccgcactcgag-3'）（序列號 16)、以及 pET21R(5'_atgtatatctccttcttaaag_3'）（序 列號17)，用PCR法擴增了 DNA片段。將得到的兩個DNA片段使用In-Fusion HD Cloning Kit(TAKARA BIO INC.制造）進行融合，得到質(zhì)粒pET-AOX。
[0167] 將質(zhì)粒 pET-AOX 導入到大腸桿菌 BL21 (DE3) (Funakoshi Corp oration 制造）， 得到BL21 (DE3)-pET-AOX株。另外，作為對照菌株，制作了將質(zhì)粒pET21a導入到大腸桿菌 BL21 (DE3)而得到的 BL21 (DE3)-pET 株。
[0168] 將這些重組菌株在含有IOOppm的氨芐青霉素鈉鹽的LB培養(yǎng)基（和光純藥工業(yè)公 司制造）中37°C、250rpm下培養(yǎng)12小時之后，接種1%至含有IOOppm的氨芐青霉素鈉鹽 的LB培養(yǎng)基中，在37°C、250rpm下培養(yǎng)2. 5小時。接下來，添加 IM IPTG溶液至最終濃度 為0.1 mM，并在25°C、250rpm下培養(yǎng)16小時。將5mL培養(yǎng)后的菌體在15000rpm、4°C下離心 2min收集菌體之后，用ImL的生理鹽水清洗2次菌體。向菌體中加入500 yL的1/15M磷酸 緩沖液（PH7. 4)懸濁，并用多珠振蕩器（安井器械公司制造）以及0.1 mm玻璃珠進行破碎。 將破碎液在4°C、15000rpm下離心5分鐘，除去了未破碎的菌體?；厥諝埩舻纳锨逡?，進行 蛋白質(zhì)濃度分析、SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分析（SDS-PAGE)和醇氧化酶活性的測定。
[0169] 蛋白質(zhì)濃度分析使用Bio-Rad蛋白定量試劑盒（Bio-Rad Protein Assay Kit) (Bio-Rad公司制造），且作為標準物質(zhì)使用牛血清白蛋白（Bio-Rad公司制造），SDS-PAGE 使用 Mini-PROTEAN TGX GEL Anyk D (Bio-Rad 公司制造）在 Mini-PROTEAN 3Ready Gel Cell (Bio-Rad公司制造）中進行。樣品使用Laemmli樣品緩沖液（Bio-Rad公司制造） 稀釋成3倍，在KKTC下保持5分鐘時間使之熱改性之后，提供給凝膠。將預混緩沖液 (IOXTris-甘氨酸-SDS(Bi 〇-Rad公司制造））用脫離子水稀釋至10倍并做成電泳液，并 且對每片凝膠以200V的恒電壓進行約30分鐘電泳。將電泳之后的凝膠用Bio-Safe CBB G-250著色劑（Bio-Rad公司制造）進行了染色。
[0170] 電泳的結(jié)果示于圖4。在圖4中，分別是第1泳道（lane 1)顯示作為對照菌株的 BL21(DE3)-pET 株，第 2 泳道（lane 2)顯示導入了 900c 0002 基因的 BL21(DE3)-pET-A0X 株。
[0171] 醇氧化酶活性的測定和上述4.同樣來進行。另外，作為活性測定的基質(zhì)是用了 1-十二烷醇。結(jié)果示于圖5中。
[0172] 從圖4可知，在導入了 900c 0002基因的BL21(DE3)-pET-A0X株中，在75kDa的位 置檢測出條帶（band)，確認了 900c 0002基因的表達。另一方面，在未導入900c 0002基因 的BL21 (DE3)-pET株中，在該位置沒有確認到條帶。
[0173] 另外，從圖5可知，在導入并表達了 900c 0002基因的BL21(DE3)-pET-A0X株中， 確認到醇氧化酶活性。但在BL21 (DE3) -pET株中，沒有確認到醇氧化酶活性。
[0174] 從這些結(jié)果可知，在上述1.中分離的900c 0002基因為作用于長鏈醇的新型醇氧 化酶基因。
[0175] 6. KSMAAOX株的糖脂質(zhì)生產(chǎn)率
[0176] 用YPD培養(yǎng)基，在30 °C、250rpm下預培養(yǎng)KSM Δ ura-ura株和KSM Δ AOX株5分鐘。 將預培養(yǎng)液接種2 %至加入了 30mLAG生產(chǎn)培養(yǎng)基的500mL坂口燒瓶（Sakaguchi flask)， 并在30°C、120rpm下培養(yǎng)48小時之后，作為基質(zhì)添加1-十四烷醇至10g/L。
[0177] 將從添加基質(zhì)開始培養(yǎng)72小時之后的培養(yǎng)液提供給下述的LC-MS分析和GC分 析。
[0178] [LC-MS 分析]
[0179] 裝置使用UFLC 20A-LCMS 2020(島津制作所公司制造），作為柱使用L-column ODS 4. 6 X 150_，5 μ m (化學物質(zhì)評價研宄機構(gòu)）。在洗脫液A中使用0.0 lM醋酸銨水溶液、 在洗脫液B中使用0.0 lM醋酸銨甲醇溶液，以流量ImL/分、柱溫箱溫度40°C，進行時間程序 50% (5分鐘）一20% /min - 90% - 95% (5分鐘）一100% (30分鐘）。檢測在負離子 模式下進行。
[0180] LC-MS分析的結(jié)果，在KSM Λ ura-ura株中沒有確認到與十二烷基麥芽糖苷相近迀 移率（mobility)的峰（10. 06分）。另一方面，在KSMΛ AOX株中在與十二烷基麥芽糖苷相 近的迀移率處確認有峰（10. 06分），在負模式下10. 068分的峰的分子量為579. 5 [M-H]， 11. 275分的峰的分子量為621. 5 [M_H]。
[0181] 這些峰認為是，乙酰基十四烷基麥芽糖苷的分子量為580. 3、2_乙酰基十四烷 基麥芽糖苷的分子量為622. 5，以及由S. Fleurackers 等Eur·J·LipidSci·Technol· (2010)，112，p. 655-662判斷10. 068分的峰為下述結(jié)構(gòu)式所表示的乙?；耐榛碧擒?(1-0-十四烷基-(2' -O-β -D-吡喃葡萄糖基-β -D-吡喃葡萄糖苷）6'醋酸酯）、11. 275 分的峰為下述結(jié)構(gòu)式所表示的乙?；耐榛碧擒眨?-0-十四烷基_(2' -O-β-D-吡喃 葡萄糖基-β -D-吡喃葡萄糖苷）6'，6"二醋酸酯）。
【主權(quán)項】
1. 一種轉(zhuǎn)化體，其中， 在具有編碼下述（a)~（c)中任一種蛋白質(zhì)的基因的宿主中，該基因缺失、變異或者表 達抑制，并且與該宿主相比醇氧化酶活性降低， (a) 由序列號1所表示的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)； (b) 由與序列號1所表示的氨基酸序列具有50%以上的同一性的氨基酸序列構(gòu)成，并 且具有醇氧化酶活性的蛋白質(zhì)； (c) 由在序列號1所表示的氨基酸序列中1個或多個氨基酸缺失、置換、插入、或者附加 而成的氨基酸序列構(gòu)成，并且具有醇氧化酶活性的蛋白質(zhì)。
2. 如權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)化體，其中， 所述宿主為微生物。
3. 如權(quán)利要求2所述的轉(zhuǎn)化體，其中， 所述微生物為酵母。
4. 如權(quán)利要求3所述的轉(zhuǎn)化體，其中， 所述酵母為屬于假絲酵母(Candida)屬的菌類。
5. 如權(quán)利要求4所述的轉(zhuǎn)化體，其中， 所述屬于假絲酵母(Candida)屬的菌類選自假絲酵母菌(Candidabomb i col a)、峰生假絲酵母菌(Candidaapicola)、假絲酵母菌(Candidabatistae)、葉牛殼假絲酵母菌 (Candidafloricola)、假絲酵母菌(Candida riodocensis)和星形假絲酵母菌(Candida stellata)〇
6. 如權(quán)利要求1~5中任一項所述的轉(zhuǎn)化體，其中， 轉(zhuǎn)化體的醇氧化酶活性相對于宿主的醇氧化酶活性為70%以下。
7. 如權(quán)利要求1~6中任一項所述的轉(zhuǎn)化體，其中， 所述（b)的蛋白質(zhì)是由與序列號1所表示的氨基酸序列具有80%以上的同一性的氨基 酸序列構(gòu)成，并且具有醇氧化酶活性的蛋白質(zhì)。
8. 如權(quán)利要求1~7中任一項所述的轉(zhuǎn)化體，其中， 所述（c)的蛋白質(zhì)是由在序列號1所表示的氨基酸序列中1~10個氨基酸缺失、置換、 插入、或者附加而成的氨基酸序列構(gòu)成，并且具有醇氧化酶活性的蛋白質(zhì)。
9. 一種包括下述（1)和（2)的工序的糖脂質(zhì)的制造方法，其中， (1) 在含有醇和糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求1~8中任一項所述的轉(zhuǎn)化體的工序；以 及 (2) 從所得到的培養(yǎng)物中采集糖脂質(zhì)的工序。
10. 如權(quán)利要求9所述的制造方法，其中， 所述醇是碳原子數(shù)為10以上且22以下的伯醇或者仲醇。
11. 如權(quán)利要求9或10所述的制造方法，其中， 所述糖脂質(zhì)為烷基葡萄糖苷或者槐糖脂。
12. -種編碼下述（a)~（c)中任一種蛋白質(zhì)的基因，其中， (a) 由序列號1所表示的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)； (b) 由與序列號1所表示的氨基酸序列具有50%以上的同一性的氨基酸序列構(gòu)成，并 且具有醇氧化酶活性的蛋白質(zhì)； (C)由在序列號1所表示的氨基酸序列中1個或多個氨基酸缺失、置換、插入、或者附加 而成的氨基酸序列構(gòu)成，并且具有醇氧化酶活性的蛋白質(zhì)。
13. -種下述（a)~（C)中任一種蛋白質(zhì)，其中， (a) 由序列號1所表示的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)； (b) 由與序列號1所表示的氨基酸序列具有50%以上的同一性的氨基酸序列構(gòu)成，并 且具有醇氧化酶活性的蛋白質(zhì)； (c) 由在序列號1所表示的氨基酸序列中1個或多個氨基酸缺失、置換、插入、或者附加 而成的氨基酸序列構(gòu)成，并且具有醇氧化酶活性的蛋白質(zhì)。
【專利摘要】本發(fā)明提供下述(a)～(c)中任一種蛋白質(zhì)、編碼該蛋白質(zhì)的基因、該基因缺失、變異或者表達抑制的轉(zhuǎn)化體、以及使用該轉(zhuǎn)化體的糖脂質(zhì)的制造方法，其中，(a)由序列號1所表示的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)；(b)由與序列號1所表示的氨基酸序列具有50％以上的同一性的氨基酸序列構(gòu)成，并且具有醇氧化酶活性的蛋白質(zhì)；(c)由在序列號1所表示的氨基酸序列中1個或多個氨基酸缺失、置換、插入、或者附加而成的氨基酸序列構(gòu)成，并且具有醇氧化酶活性的蛋白質(zhì)。
【IPC分類】C12N9-04, C12N1-19, C12P19-00, C12N5-10, C12N15-09
【公開號】CN104736705
【申請?zhí)枴緾N201380054186
【發(fā)明人】高橋史員
【申請人】花王株式會社
【公開日】2015年6月24日
【申請日】2013年10月3日
【公告號】EP2910631A1, US20150267235, WO2014061459A1