直接核酸擴(kuò)增試劑盒、試劑和方法
【專利說明】直接核酸擴(kuò)增試劑盒、試劑和方法 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及核酸擴(kuò)增的領(lǐng)域，特別是涉及使用聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增核酸的用途。為 容易地?cái)U(kuò)增核酸樣品，本發(fā)明提供可用于通過凍干或冷凍-干燥核酸擴(kuò)增試劑擴(kuò)增核酸的 方法和試劑盒。本發(fā)明具有在容易地處理核酸中的應(yīng)用和在基因分型、診斷和法醫(yī)方面是 特別有用的。
[0002] 發(fā)明背景 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR)是用于分子生物學(xué)供擴(kuò)增核酸的常見工具。US4683202 (Mullis, Cetus Corporation)描述了用于擴(kuò)增在核酸或其混合物中所含的任何所需特定核酸序列 的方法。
[0003] US5705345 (Lundin等人）描述了核酸制備的方法，其中含有細(xì)胞的樣品被溶胞 以釋放核酸和樣品用環(huán)糊精處理以中和萃取劑。這種系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)是傳統(tǒng)的去垢劑去除需要 一個(gè)分離步驟；然而加入環(huán)糊精以中和去垢劑排除了對分離步驟的需要，因此減少了污染 的危險(xiǎn)。
[0004] W0"38962 (Health, Gentra Systems Inc.)描述了一種具有結(jié)合的溶胞試劑的 固體支持體。溶胞試劑可包含去垢劑、螯合劑、水和任選的RNA消化酶。用于PCR擴(kuò)增的方 法需要純化核酸用于擴(kuò)增分析的其它步驟。
[0005] W09102040 (Kosak)描述了在擴(kuò)增反應(yīng)混合物中使用環(huán)糊精標(biāo)記的引物用于定性 和定量核酸序列分析的發(fā)明。該發(fā)明的益處是更高的信號效率和標(biāo)記顏色的通用性。
[0006] W09532739 (Agrawal)描述了與環(huán)糊精非共價(jià)復(fù)合的寡核苷酸。然而環(huán)糊精與寡 核苷酸的結(jié)合是用于寡核苷酸的細(xì)胞攝取而不用于PCR反應(yīng)中的核苷酸的擴(kuò)增。
[0007] W02010066908 (Beckers等人，）描述了環(huán)糊精改進(jìn)PCR的特異性、靈敏度和/或 產(chǎn)率的用途。該方法公開在包含至少一種環(huán)糊精的反應(yīng)混合物中進(jìn)行的擴(kuò)增反應(yīng)且該擴(kuò)增 反應(yīng)在反應(yīng)混合物上進(jìn)行。該P(yáng)CT申請公開了用于在樣品中擴(kuò)增目標(biāo)核酸的試劑盒，所述 試劑盒在同一容器中包含至少一種環(huán)糊精和至少一種選自PCR試劑列表的成分。該申請還 公開試劑盒可作為包含幾種成分的預(yù)混合物提供，其也可以脫水的凍干的形式提供。然而， 該申請中沒有這樣凍干的預(yù)混合試劑盒或者甚至此類試劑盒可如何制備的實(shí)例。
[0008] 用于DNA擴(kuò)增的當(dāng)前方法涉及通常包含幾個(gè)步驟的DNA純化程序，其增加污染的 機(jī)會(huì)。這是一個(gè)繁瑣的過程，而現(xiàn)有技術(shù)的方法在成本、復(fù)雜性和特別是用戶的時(shí)間方面具 有許多明顯的缺點(diǎn)。例如，基于柱的核酸純化是典型的純化核酸的固相提取方法。這種方 法依賴于通過吸附結(jié)合于二氧化硅或其它支持體（取決于緩沖液的PH和鹽含量）的核酸。 合適的緩沖液的實(shí)例包括Tris-EDTA (TE)緩沖液或磷酸鹽緩沖液（由于反應(yīng)性胺而用于 DNA微陣列實(shí)驗(yàn)）。在這樣的離心柱（spin column)上的核酸純化包括許多復(fù)雜和繁瑣的 步驟。在離心柱上的核酸純化通常包括3個(gè)耗時(shí)和復(fù)雜的步驟/階段： 將含有核酸的樣品加入到柱中和由于結(jié)合溶液的較低的PH (相對于在柱上的硅烷 醇基）和鹽濃度所致核酸結(jié)合，所述結(jié)合溶液可含有緩沖液、變性劑（如鹽酸胍）、Triton X-IOO、異丙醇和pH指不劑； 用5 mM KPO4 pH 8· O或類似的，80% EtOH)洗滌柱；和 用緩沖液或水洗脫柱。
[0009] 備選方法包括在離液劑的存在下核酸的結(jié)合，以致DNA結(jié)合于二氧化硅或玻璃顆 ?；虿Ａе椤＿@個(gè)屬性被用于在堿性條件下使用玻璃粉末或二氧化硅珠純化核酸。典型的 離液劑包括硫氰酸胍W或鹽酸胍纖，最近玻璃珠已被含有玻璃的微柱取代。
[0010] 定量實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)的某些缺陷，包括抑制劑的作用，由Bustin & Nolan (J. Biomolecular Techniques, 2004，15，155-166)描述。
[0011] 在法醫(yī)應(yīng)用中針對PCR擴(kuò)增失敗的最好防御是將合理的樣品處理和加工技術(shù)與 被證明有效純化DNA的提取系統(tǒng)結(jié)合。
[0012] 典型地，PCR試劑貯存在必須維持在低于室溫的溫度下的甘油溶液中。凍干法或 冷凍干燥是一種廣泛用于制備供核酸分析和其它生物過程的試劑的方法，因?yàn)樗试S否則 不穩(wěn)定的生物分子的長期穩(wěn)定性，并提供一種儲(chǔ)存、運(yùn)輸和重構(gòu)的便利方法。然而在涉及制 備用于PCR分析的凍干或冷凍-干燥的試劑方面存在許多技術(shù)挑戰(zhàn)。制備干燥生物試劑組 合物的當(dāng)前技術(shù)包括諸如干式混合、噴霧干燥、冷凍干燥、流化床干燥和/或低溫冷凍的步 驟。所有這些步驟都有限制和缺點(diǎn)，包括一致性和可靠性。
[0013] 在干式混合技術(shù)（Muzzio等人2002, /Wofer TechnologyY2A,卜7)的情況下，由 于化學(xué)物的不同的密度，往往很難獲得均勻的化學(xué)物的共混物。此外，當(dāng)極小量的成分與大 量的其它成分混合時(shí)，均勻性是尤其難以獲得的。即使獲得均勻性，也難以可重復(fù)地分散小 量的共混的生物化學(xué)物。
[0014] 由于試劑首先溶于溶液中，噴霧-干燥技術(shù)（US4712310)提供更均勻的化學(xué)物的 共混物。然而，在噴霧-干燥的情況下，分發(fā)精確量的共混化學(xué)物是困難的。為克服這個(gè)缺 點(diǎn)，產(chǎn)生的顆粒通常通過團(tuán)聚再加工以獲得均勻的顆粒大小如片劑。然而，團(tuán)聚的顆粒通常 比原始噴霧-干燥的顆?；蚍勰└蝗?。同樣，這些程序有時(shí)使用可對環(huán)境有害的碳氟化 合物低溫溶液。
[0015] 流化床技術(shù)（Rubina, 1999，TfecAffo/ogT'，23, 104-113)依賴 于將液體試劑共混物噴霧到顆粒上并干燥液體以獲得用共混的試劑包被的顆粒。使用該程 序，難以獲得均勻大小的顆粒并產(chǎn)生均勻的包衣。
[0016] 用于穩(wěn)定生物制劑的另一種方法是冷凍-干燥。冷凍-干燥的一個(gè)缺點(diǎn)是使用難 以處理的碳氟化合物制冷劑和冷凍-干燥過程可能是不精確的并且還難以調(diào)節(jié)。確實(shí)，試 劑的常規(guī)冷凍干燥不能提供對用于分子生物學(xué)過程的特別不穩(wěn)定試劑的完整解決方案。此 外，產(chǎn)品在冷凍干燥過程期間的降解是常見的和冷凍干燥的產(chǎn)品在存儲(chǔ)期間并不總是完美 穩(wěn)定的。過程控制是至關(guān)重要的并且可能難以調(diào)節(jié)（Tang & Pakil, 2004，藥物冷凍-干 燥方法的設(shè)計(jì)：實(shí)用建議（Design of Freeze-Drying Processes for Pharmaceuticals: Practical Advice) -,Pharmaceutical Research, 21, 191-200) 〇
[0017] 穩(wěn)定生物制劑的另一種方法是通過空氣-干燥生物試劑組合物（Ratti，2001， 高價(jià)值食品的熱空氣和冷凍-干燥：評述（Hot Air and Freeze-Drying of High Value Foods: A Review) : A Review. J. Food Engineering 49, 311-319)。使用空氣干燥方法 的一些問題是，干燥的產(chǎn)品并不以可容易分散的形式存在。而且，生物試劑在或高于干燥過 程的溫度下必須是穩(wěn)定的并且精確控制是一個(gè)困難的過程。
[0018] 使用冷凍-干燥技術(shù)的一個(gè)特化方法是形成液滴或球，其與低溫液體接觸，然后 冷凍干燥。該技術(shù)的一個(gè)缺點(diǎn)是試劑球是脆弱的且易于崩解。
[0019] 用于穩(wěn)定生物試劑的載體或填充劑的一個(gè)類型是形成玻璃的填充材料 (US5565318)。將生物試劑溶液摻入形成玻璃的填充材料（其為水溶性的或水溶脹性物質(zhì)） 中。然后將它們干燥以產(chǎn)生一種固定和穩(wěn)定生物試劑的玻璃狀組合物（US5593824)。
[0020] 碳水化合物如葡萄糖、蔗糖、麥芽糖或麥芽三糖是一組重要的玻璃形成物質(zhì)。可使 用其它多羥基化合物如碳水化合物衍生物像山梨醇和化學(xué)改性的碳水化合物。另一種重要 類別的玻璃形成物質(zhì)是合成的聚合物如聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酰胺或聚乙烯亞胺。
[0021] 玻璃形成物質(zhì)的其它實(shí)例包括糖共聚物如Ficoll? (US3300474)。Ficoll是一種 易溶于水性溶液的中性的、高度支化的、高質(zhì)量、親水性多糖。Ficol 1的半徑范圍為2-7 nm。 其通過多糖與表氯醇的反應(yīng)來制備。Ficoll具有在5, 000-1，000, 000之間的分子量并包含 通過醚鍵連接至雙官能團(tuán)的蔗糖殘基。這樣的基團(tuán)可以是2、3或更多個(gè)碳原子，但通常不 超過10個(gè)碳原子的亞烷基。雙官能團(tuán)起著將