印tin9和RNF180這兩個生物標記物的同時間的雙通道檢測，并且能根據(jù)實時PCR的循環(huán) 閾值（ct)值來快速、便捷地判斷樣本是否呈陽性，提供了一種無創(chuàng)性的快速的癌癥和炎癥 的分級方法。
[0053] 除非另外定義，本說明書中有關技術的和科學的術語與本領域內的技術人員所通 常理解的意思相同。雖然在實驗或實際應用中可以應用與此間所述相似或相同的方法和材 料，本文還是在下文中對材料和方法做了描述。在相沖突的情況下，以本說明書包括其中定 義為準，另外，材料、方法和例子僅供說明，而不具限制性。
[0054] 本發(fā)明的其他特點和優(yōu)勢將由下面的具體說明和權利要求書作詳細的描述。
【附圖說明】
[0055] 本發(fā)明的上述及其他特征將通過下面結合附圖及其詳細描述作進一步說明。應當 理解的是，這些附圖僅示出了根據(jù)本發(fā)明的若干示例性的實施方式，因此不應被視為是對 本發(fā)明保護范圍的限制。除非特別說明，附圖不必是成比例的，并且其中類似的標號表示類 似的部件。
[0056] 圖1顯示在S印tin9和RNF180的甲基化DNA多元檢測中，RNF180四組引物和探 針均不影響Septin9的測定。
[0057] 圖2顯示S印tin9和RNF180的甲基化DNA多元檢測胃癌的陽性結果互補。
[0058] 圖3顯示S印tin9和RNF180的甲基化DNA多元檢測胃癌、胃炎和正常人的Ct平 均值柱狀圖。
[0059] 圖4顯示S印tin9和RNF180的甲基化DNA多元檢測胃癌、胃炎和正常人的Ct值 散點圖。
[0060] 圖5顯示正常人、淺表、萎縮/腸化、胃癌I期、II期、III期、IV期中0-肌動蛋 白的Ct值恒定。
[0061] 圖6顯示正常人、淺表、萎縮/腸化、胃癌I期、II期、III期、IV期中RNF180的 dCt值。
[0062] 圖7A-7C分別顯示正常人、淺表、萎縮/腸化、胃癌的RS19陽性率比較，胃癌I期、 II期、III期、IV期的RS19陽性率比較；以及正常人、胃炎、胃癌的RS19的dCt平均值柱狀 圖。
[0063] 圖8A顯示RNF180甲基化含量與年齡的關系圖；圖8B顯示Septin9和RNF180結 合改善胃癌檢測的特異性和靈敏度的示意圖。
[0064] 圖9顯示S印tin9和RNF180的甲基化DNA多元（RS19)檢測正常、胃癌的靈敏度 和特異性。
[0065] 圖10顯示S印tin9和RNF180的甲基化DNA多元（RS19)檢測正常、胃炎（慢性、 淺表性、潰瘍性）的靈敏度和特異性。
[0066] 圖11顯示S印tin9和RNF180的甲基化DNA多元（RS19)檢測正常、胃炎（全部） 的靈敏度和特異性。
【具體實施方式】
[0067] 除非另有說明，本申請的實施將采用常規(guī)的分子生物學（包括重組技術）、微生 物學、細胞生物學、生物化學和基因學技術，其均在本領域常規(guī)技術手段的范圍內。在文 獻中對此類技術進行了詳細說明如MolecularCloning:ALaboratoryManual,第二版(Sambrook等，1989) ;01igonucleotideSynthesis(M.J.Gait，1984 版）；AnimalCell 〇1111：11代(1?.1.卩代8111167，1987版）；]^1:11〇(18；[11￡112：71]1〇1〇87叢書（美國學術出版社有限公 司）；CurrentProtocolsinMolecularBiology(F.M.Ausubel等，1987 版，和定期更新）； PCR:ThePolymeraseChainReaction(Mullis等，1994 版）。本申請中使用的引物、探針 和試劑盒可以采用本領域公知的標準技術制備。
[0068] 除非另有定義，本申請所使用的技術和科學術語與本發(fā)明所屬領域的普通技 術人員的通常理解具有相同的含義。Singleton等，DictionaryofMicrobiologyand MolecularBiology，第二版，J.Wiley&Sons(NewYork,N.Y. 1994)，和March,Advanced OrganicChemistryReactions,MechanismsandStructure, 第四版，John Wiley&Sons(NewYork，N.Y. 1992)，針對本申請中使用的多個術語為本領域技術人員提供 了一般性的指導。
[0069] 定義
[0070] 本申請的"對疾病程度進行分級"表示根據(jù)檢測結果來確定疾病的程度，從而進行 分級。根據(jù)本申請，可以根據(jù)DNA甲基化的程度區(qū)分正常和癌癥兩個等級，即可以檢測個體 中的癌癥。優(yōu)選地，根據(jù)本申請，可以根據(jù)DNA甲基化的程度區(qū)分正常、炎癥和癌癥三個等 級。例如，可以根據(jù)患者的樣本所測的DNA甲基化的程度，來區(qū)分正常、胃炎和胃癌三個等 級，并且對于胃炎還可以進一步區(qū)分淺表性胃炎和萎縮性胃炎。
[0071] 本申請的"癌癥"表示并包括任何惡性腫瘤（malignancy)、或惡性細胞分裂或惡性 腫瘤（malignanttumour),或具有不受控制的或不適當?shù)募毎鲋车娜魏渭膊顟B(tài)，并且 包括但不限于特征為不受控制的或不適當?shù)募毎鲋车娜魏渭膊　?br>[0072] 本申請的"胃癌（gastriccancer) "和"胃癌（stomachcancer) "具有相同含義， 并且表示胃或胃細胞的癌癥。這些癌癥可以是發(fā)生于胃的內層（粘膜）并且可以發(fā)生于胃 的幽門部、胃體部或賁門部（下部、體部和上部）的腺癌。
[0073] 本申請的"胃癌分期"是指可以根據(jù)胃癌的臨床病理分期標準，將胃癌分為四期。 其中胃癌分期涉及以下三個指標：原發(fā)腫瘤（T)、淋巴結轉移情況（N)和遠處轉移情況（M， 包括左鎖骨上淋巴結轉移、血行轉移和腹腔種植）。"I期"指無淋巴結轉移的表淺型胃癌， 或腫瘤雖已經侵及肌層但不超過一個分區(qū)1/2;"11期"指有第一站淋巴結轉移的表淺癌、 T2癌（腫瘤侵及胃壁肌層，但大小不超過一個分區(qū)的1/2)和T3癌（腫瘤侵及胃壁漿膜層， 或者雖未侵及漿膜層，但病變已經超過一個分區(qū)的1/2,但未超出一個分區(qū)），沒有淋巴結 轉移的T3癌也屬此期；"III期"指有第二站淋巴結轉移的各種大小腫瘤，或僅有第一站淋 巴結轉移甚或無淋巴結轉移的腫瘤大小已經超過一個分區(qū)者；而"IV期"指凡是伴有第三 站淋巴結轉移或者遠處轉移的，無論腫瘤大小，均屬此期。
[0074] 本申請的"胃癌細胞"表示具有胃癌特征的細胞，并且包括癌癥前期細胞。
[0075] 本申請的"癌癥前期"表示處于轉化為癌細胞的早期階段或傾向于轉化為癌細胞 的細胞。這樣的細胞可以表現(xiàn)出一種或多種具有癌細胞特征的表型性狀。
[0076] 本申請的"胃炎"表示任何病因引起的胃黏膜炎癥，常伴有上皮損傷和細胞再生。 胃炎是最常見的消化系統(tǒng)疾病之一，一般按照臨床發(fā)病的緩急分為急性胃炎和慢性胃炎。 而慢性胃炎一般分為以下幾個類型：炎癥病變比較表淺，局限在胃粘膜表面一層（不超過 三分之）者，稱作"淺表性胃炎"，而如果發(fā)展成胃部潰瘍的話，就變成了"潰瘍性胃炎";而 炎癥病變波及胃粘膜的全層，并伴有胃腺體萎縮者，則為"萎縮性胃炎"。其中，在萎縮性胃 炎患者中，病理活檢發(fā)現(xiàn)胃黏膜有"結腸型不完全性腸上皮化生"和"不典型增生"這兩種 病變者，有可能發(fā)展成胃癌。所謂腸上皮化生（簡稱腸化），是指胃黏膜腺體中出現(xiàn)了正常 時不應該有的小腸或結腸的腺體，即腸腺遷居胃內。腸化數(shù)量越多，萎縮程度也就越重。淺 表性胃炎和潰瘍性胃炎可以統(tǒng)稱為"輕度胃炎"；而"萎縮性胃炎"和"腸化性胃炎"則可以 統(tǒng)稱為重度胃炎。
[0077] 本申請中的"生物標記物"指的是一種諸如基因的物質、與疾病相關的變量測定， 可以作為那個疾病的指示因子或預測因子。疾病的存在或風險可以從生物標記物這個參數(shù) 推斷出來，不需要測定疾病本身。
[0078] 本申請中的"核酸"、"核酸序列"等等，指的是聚核苷酸，可以是gDNA、cDNA或RNA， 也可以是單鏈或雙鏈的。術語也包括肽核酸（PNA)，或任何化學的DNA類或RNA類物質。 "cDNA"指的是從天然生成的mRNA復制的DNA。"gDNA"指的是基因組DNA。也可以使這些 物質的組合（即部分是gDNA和部分是cDNA的重組核酸）。
[0079] 本申請中的"可操作地結合"、"可操作地連接"指的是功能上結合核酸序列。
[0080] 本申請中的"嚴緊雜交條件"和"高度嚴緊"指的是探針與其靶子序列雜交的條 件，典型的在核酸復雜的混合物中。嚴緊的條件是依賴于序列的，并且在不同的環(huán)境下是不 同的。較長的序列在較高的溫度中特異性的雜交。關于核酸雜交的詳細的指導可以參考 Tijssen，生物化學和分子生物學技術-核酸探針雜交，"雜交原理和核酸試驗策略的回顧"。 通常，嚴緊條件是在限定的離子強度pH下低于特定核酸的熔點（Tm)大約5-10°C。在Tm的 溫度（在所限定的離子強度，pH和核酸濃度）下，50%的和靶點互補的探針均衡地和靶點 序列雜交。還可以通過增加去穩(wěn)定劑來實現(xiàn)嚴緊條件。對于選擇性或者特定的雜交，正信 號為背景雜交的兩倍，優(yōu)選10倍。示例性的嚴緊雜交條件如下：在50%甲酰胺，5xSSC和 1 %的SDS的溶液中在42攝氏度雜交，或者在5xSSC和1 %的SDS的溶液中在65攝氏度雜 交，然后在〇. 2xSSC和0. 1 %SDS的溶液中在65攝氏度洗滌。
[0081] 并且，如果核酸所編碼的多肽是實質性相似的話，即使不能在嚴緊條件下雜交的 核酸仍然是實質性相似的。這種情況下，典型地，核酸在中等嚴緊雜交條件下進行雜交。作 為示例的，"中等嚴緊雜交條件"包括在40%甲酰胺，1M的氯化鈉和1%的SDS的溶液中在 37攝氏度雜交，并且在lxSSC的溶液中在45攝氏度洗滌。本領域的普通技術人員可以很顯 然地在現(xiàn)有技術中獲得對于取得獲得相同的嚴緊度的條件的指導。對于PCR而言，36攝氏 度左右的溫度典型地適用于低度嚴緊擴增，而基于引物的長度，退火溫度的范圍則在32攝 氏度至48攝氏度之間。對于高度嚴緊的PCR擴增，一般是在62攝氏度，而基于引物的長度 和特異性，高度嚴緊雜交的退火溫度的范圍則在50攝氏度至65攝氏度之間。對于高度嚴 緊和低度嚴緊擴增的循環(huán)條件，典型的，包括：在90-95攝氏度下持續(xù)變性階段30秒至2分 鐘，持續(xù)退火階段30秒至2分鐘，在約72攝氏度下持續(xù)擴展階段1至2分鐘。關于低度和 高度嚴緊擴增反應的工具和指導可以在現(xiàn)有技術中獲得。
[0082]本申請中的"寡核苷酸"指由兩個或者兩個以上的核苷酸構成的分子，優(yōu)選為由三 個以上的核苷酸構成的分子，其精確大小可以依靠許多因素，這些因素反過來又是由寡核 苷酸的最終功能和用途決定的。在某些【具體實施方式】中，寡核苷酸可以包括10個核苷酸至 100個核苷酸的長度。在某些【具體實施方式】中，寡核苷酸可以包括10個核苷酸至30個核苷 酸的長度，或者可以具有20和25個核苷酸的長度。在一些特定的【具體實施方式】中，短于這 些長度的寡核苷酸也是合適的。
[0083] 本申請的"引物"表示當置于能誘發(fā)與核酸鏈互補的引物延伸產物的合成的條件 下，即在核苷酸和諸如DNA或RNA聚合酶的誘發(fā)劑的存在下并且在合適的溫度和pH下，能 夠作為合成起始點的寡核苷酸，無論它是純化的限制性消化物中天然存在的或合成產生 的。引物可以是單鏈或雙鏈的，并且必須足夠長而使其在誘發(fā)劑的存在下能引發(fā)所需延伸 產物的合成。引物的確切長度取決于多種因素，包括溫度、引物來源和所用的方法。例如，為 了診斷和預后應用，根據(jù)靶序列的復雜性，寡核苷酸引物通常含有至少或多于約10、或15、 或20、或25或更多個核苷酸，但是其可以含有更少核苷酸或更多核苷酸。參與確定引物合 適長度的因素是本領域技術人員熟知的。
[0084] 本申請的"引物對"表示與靶DNA分子相反鏈雜交或與側翼連接待擴增的核苷酸 序列的靶DNA區(qū)域雜交的引物對。
[0085] 本申請的"引物位點"表示引物雜交的靶DNA或其它核酸的區(qū)域。
[0086] 本申請的"探針"，當涉及核酸序列時，以其通常含義使用，表示在規(guī)定條件下能與 靶序列雜交并且可以用于檢測該靶序列的存在的選擇的核酸序列。本領域技術人員應當理 解，在某些情況下，探針也可以用作引物，并且引物可以用作探針。
[0087] 本申請的"DNA甲基化"是指甲基添加到胞嘧啶（C)的5位，這通常（但不必須） 是在CpG(胞嘧啶之后為鳥嘌呤）二核苷酸的情況下。本文所用的"增加的甲基化程度"或 "顯著的甲基化程度"是指DNA序列中至少存在一個甲基化的C核苷酸，其中正常對照樣品 (例如從非癌細胞或組織樣品提取的DNA樣品或對DNA殘基的甲基化進行處理的DNA樣品） 中的對應C是非甲基化的，在某些實施方案中，至少2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個C可以 是甲基化的，其中對照DNA樣品中的這些位置的C是非甲基化的。
[0088] 在實施方案中，多種不同的方法可用于檢測DNA甲基化改變。檢測DNA甲基化的 方法包括，例如，利用southern或聚合酶鏈反應（PCR)分析的甲基化敏感的限制性內切核 酸酶（MSRE)測定、甲基化特異性或甲基化敏感的PCR(MS-PCR)、甲基化敏感的單核苷酸引 物延伸（Ms-SnuPE)、