A、Slpa、Eseptin、Msf、septin樣蛋白卵巢/乳腺septin (0v/ Brs印tin)以及S印tin D1)位于染色體17q25位于疊連群AC068594. 15. 1. 168501內(nèi)，為 S印tin基因家族的成員。例如，SEQ ID N〇:13提供了S印tin9的富含CpG的啟動子區(qū)域的 序列。
[0113] SEQ ID No:13序列如下所示：
[0114] CGTTACCCGAGTTGTAAAGGGCGGCTCCCTGTGTCTGCCCCGCTGCACCGATACACCGA
[0115] GCTGCGCACGGTGCCCAGCGCAGGGAGAACAAATGATCATCTGTCCAACGCGCCCATT
[0116] TACAGGTGAGGAAACTAAGGCTCCAACTCAATCGACGCACTCTGCCCTTTTGATTACCA
[0117] GAAAAGTAGCAGGACAGGTGTCCTGTCCCGCCCTACCCCGGCCCACTAAGCCGGCACC
[0118] CCGGCTCCGACCCCCGGCTGTGCCCGGCGCCGCCGCGGTGCCCGGCGCCGCCGCCTCG
[0119] CCCGGCGGGGCCGCCCGGAGCGCCCGCACCTCCGCCCGCTTCCACCTGGCCGGGCCCG
[0120] CCCCGCCCGGACTCGGGACTGGGAAGTGCGGCGACTCCCGGAACCAGCCATTGGCGCC
[0121] AGCGCGGGGAGCTGGGGGTGCAGAGCTGCGGGCGCGGCGGGCCACGCAGGCGGCCCC
[0122] CACCCCCGGCCTGGCCTGGTCTGGTCTGGTCTGCGCTGCCGCGCGGGGGCGCCCCCTCC
[0123] CAGGCCCGGCGCCCGCCAGCCCCGCTCCGCCAGGTGCAGCGCAGCGCAGGGGTGGGC
[0124] GGGGGTGGGGCTCGGCGCGCACGTTCACGGGGCGGGGAGGGGGCGGGTCAGGGGCGG
[0125] GACCACAGCCGGCTGGGCCGGGGTTCTATGCGCATCTCCGGGGAGGGGCGGGGCGGG
[0126] GGCGGGGCCGGGGCGGGGCCCGGTCGGTGCACTCCAGACGGCGGGCCGCCCCCTCTTC
[0127] CCGCCTTCCTACTACCGGCCCAGGATTAGCGCCCTGGGAGCGCGCGCCCCGCTGCCTCG
[0128] CCGCCACACTTTCCTGGGAGCGGCGGCCACGGAGGCACCATGAAGAAGTCTTACTCAG
[0129] GTGGGCTTCGCGCCCGGGGTGGGGAGGGGTCGGTGTCCCGGGACCAGCGCTGCTCACC
[0130] TGAGTGCCTGCGGCCGGGAGTGGCGAGGCGCCCCCGGAGCTGAGCGAGTCCCCGCGGC
[0131] GGGCACACTGCAGGTCGAGTTCCTCCCAGGACAGGGCCGCTGTCGGGCCGCTTTCGAC
[0132] CTGAGCCGACCGTCCCCTGCGCTGTCTCCAGCCCTTGCTCGAGTGTCGGAGGGGCTGCC
[0133] CTGGGGGACGCTCCCTCTTCCTCGCCCCTTGCACCCTCGCAGGAATCGCTGACTTTCCA
[0134] GGTCGGCCGGGTGCTTTGGGTCCCTGTGCGTCTGTGTGGGTGAATGGGGTCGGGGCTA
[0135] GGTGGAGGGGTGTCCTTGGGTTCAGCCTCTAGGGCTGGTGGTCCAGGCCGCAGCATCC
[0136] TTTCTTCGGATTCTCTTCGGTTTCTCCTCTACTTAGTGGGGCACGGGACGGCCTCCAGAT
[0137] GGGACCGTCCAGCAGCGCCCAAACTTGGCGACTCGGGTTCACGTTTTGCGCTCAGGAC
[0138] GCCGCCCGC
[0139] S印tin基因家族的成員與從膜泡運輸?shù)桨|(zhì)分裂的多種細胞功能相關(guān)。破壞 Septin9的作用將導致不完全的細胞分裂，Septin9和其它的蛋白已顯示為原癌基因MLL的 融合伴侶分子（fusionpartner),這表明了在腫瘤發(fā)生中的作用。
[0140] 用于檢測Septin9基因及其片段中至少一個靶區(qū)域內(nèi)是否存在甲基化的核酸序 列包括：等同于或互補于或在中等嚴緊或嚴緊條件下雜交于選自SEQIDN0 :13的連續(xù)序 列的至少9個堿基長片段。
[0141] 而根據(jù)一種【具體實施方式】，用于檢測RNF180基因及其片段中至少一個靶區(qū)域內(nèi) 是否存在甲基化的核酸序列可以包括：等同于或互補于或在中等嚴緊或嚴緊條件下雜交于 由如下所示的RNF180的啟動子區(qū)域SEQ ID No :10的至少15個核苷酸及其互補序列，SEQ ID No :10對應(yīng)于Genbank接入號：NMi001113561chr5163497153-63497758。其中下劃線標 示"轉(zhuǎn)錄開始位點"。
[0142] 根據(jù)某些優(yōu)選實施方式，可以基于SEQIDNo:10的序列，設(shè)計引物和探針。其 中適用于作為PCR擴增的引物和探針的序列，可以包括任何合適的長度，例如可以包括至 少15個的核苷酸，或者可以包括至少20, 25, 30, 35, 40, 45個或者多于50個的核苷酸。 在這些【具體實施方式】中，核酸序列可以和SEQIDN0:10的序列或者其互補序列具有約 95% ,96% ,97% ,98%或 99%的相似性。
[0143]SEQIDNo:10 (轉(zhuǎn)錄開始位點的-234bp至 +372bp)
[0144] GATAATTTCTGTGGCTCTGGTAAGGGGATGACAAGGGAGAAAAACTTTCCCACGGTTCC
[0145] GTCTGGCCCGCGGCGCTTGTCTGCCTGCGCGGGGTCAAAGCCCGGCGCCGCCCACGCG
[0146] CGGCTCGGGTGGGAACCCGCAGACGTGGGGCGAGCAGGGCCGCTGGCTGTGGCGGGC
[0147] GAGCGCCGGGGCGCCACGTCCGAGGCCGCGGGGTCGGGGCTGCAGGCACAGCTCGAG
[0148] CGCTTTCCGCGGGGTTTGGCTCCTGTCGCTTCCCGTCTCGCCGAACCGGCATCGCCGCC
[0149] GCCGGAGCCGCAGCGAGTCCTCAGAGCCTGGCTGCTGGCGGCCGGGAGCGCCGGGAC
[0150] GGGGCGCGAAGCCGGAGGCTCCGGGACGTGGATACAGGTAAAGGCCGGCGGGTCGGA
[0151] GTCGGGCGGGGCGCGGCGGCGGCGCCTCTCGGAGGGACCTGGCCTCGGCCGGGCCCTA
[0152] CCCAGCCGCGGTGGCCCGGGCCCCCACGTTGGCCCAGGCGGGGACGTGCCAAGGGGCT
[0153] GGGCTAGGGTTGCCGCTGGCCTGGCCGCCTCTCGCCCGGCGGGCCTCAGGTGACGCGG
[0154] CCGCGGCTTAACTTTCGCACCTGAGGCT
[0155] 而優(yōu)選的，用于檢測RNF180基因及其片段中至少一個靶區(qū)域內(nèi)是否存在甲基化 的核酸序列包括：等同于或互補于或在中等嚴緊或嚴緊條件下雜交于由如下所示SEQID No: 11的至少15個核苷酸及其互補序列。
[0156]SEQIDNo:11(轉(zhuǎn)錄開始位點的-167bp至 +135bp)
[0157] CGCGGCGCTTGTCTGCCTGCGCGGGGTCAAAGCCCGGCGCCGCCCACGCGCGGCTCGG
[0158] GTGGGAACCCGCAGACGTGGGGCGAGCAGGGCCGCTGGCTGTGGCGGGCGAGCGCCG
[0159] GGGCGCCACGTCCGAGGCCGCGGGGTCGGGGCTGCAGGCACAGCTCGAGCGCTTTCCG
[0160] CGGGGTTTGGCTCCTGTCGCTTCCCGTCTCGCCGAACCGGCATCGCCGCCGCCGGAGCC
[0161] GCAGCGAGTCCTCAGAGCCTGGCTGCTGGCGGCCGGGAGCGCCGGGACGGGGCGCGA
[0162] AGCCGGAGGCTCC
[0163] 進一步優(yōu)選的，用于檢測RNF180基因及其片段中至少一個靶區(qū)域內(nèi)是否存在甲 基化的核酸序列可以包括：等同于或互補于或在中等嚴緊或嚴緊條件下雜交于由如下所示 SEQIDNo: 12的至少15個核苷酸及其互補序列。
[0164] SEQIDNo:12(轉(zhuǎn)錄開始位點的 _43bp至 +135bp)
[0165] GTCCGAGGCCGCGGGGTCGGGGCTGCAGGCACAGCTCGAGCGCTTTCCGCGGGGTTTG
[0166] GCTCCTGTCGCTTCCCGTCTCGCCGAACCGGCATCGCCGCCGCCGGAGCCGCAGCGAGT
[0167] CCTCAGAGCCTGGCTGCTGGCGGCCGGGAGCGCCGGGACGGGGCGCGAAGCCGGAGG
[0168] CTCC
[0169] 因此，可以設(shè)計TaqMan探針和引物用于檢測RNF180基因啟動子區(qū)域（轉(zhuǎn)錄開始 位點的_234bp至+372bp)的DNA甲基化，優(yōu)選檢測的啟動子區(qū)域是轉(zhuǎn)錄開始位點的-167bp 至+135bp，更優(yōu)選檢測的啟動子區(qū)域是轉(zhuǎn)錄開始位點的-43bp至+135bp，用于檢測的擴增 子大小范圍是從66bp至130bp。
[0170] 例如，在某些【具體實施方式】中，以SEQIDNo:12(轉(zhuǎn)錄開始位點的_43bp至 +135bp)為靶點區(qū)域設(shè)計用于檢測RNF180基因及其片段中至少一個靶區(qū)域內(nèi)是否存在甲 基化的引物和探針。所以，根據(jù)申請，可以設(shè)計很多套探針和引物的組合，而每一套探針和 引物的組合的性能可能存在差別。所以，為了篩選高效的引物和探針，本申請通過以下步驟 利用人造甲基化模板和非甲基化模板，以及癌癥（例如胃癌）和正常DNA做模板，對所設(shè)計 的多套探針和引物組合進行了篩選：
[0171] 1.設(shè)計RNF180基因啟動子區(qū)域的引物和探針。
[0172] 2.設(shè)計人造甲基化DNA和非甲基化DNA。
[0173] 3.利用人造甲基化DNA和非甲基化DNA篩選引物和探針，人造甲基化DNA有擴增， 人造非甲基化沒有顯示擴增。
[0174] 4.利用從正常白細胞DNA中提取的DNA篩選引物和探針。
[0175] 5.如果在正常人白細胞DNA中沒有擴增或擴增很少，那么利用從人胃癌組織中提 取的DNA篩選引物和探針。
[0176] 6.從臨床研究階段正常血漿中提取的DNA篩選引物和探針。
[0177] 7.如果在臨床研究階段正常血漿中沒有擴增或擴增很少，那么利用從胃癌病人中 提取的DNA篩選引物和探針。
[0178] 通過上述篩選，構(gòu)建了以下序列SEQIDN0:1-9作為引物和探針：
[0179] 引物：SEQIDNol (180F7) 5,-GTTCGAGGTCGCGGGGTC-3'
[0180] 探針：SEQIDNo2 (180P7) 5,-CALFluorRed-AACGCTCGAACTATACCTACAACCCC-B HQ2-3，
[0181] 引物：SEQIDNo3 (180R7) 5,-ACAAAAACCAAACCCCGCG-3'
[0182] 引物：SEQIDNo4 (180F24) 5,-GCGGGGTTTGGTTTTTGT-3'
[0183] 探針：SEQIDNo5 (180P2) 5,-CALFluorRed-CCGACGACGACGATACCG-BHQ2_3'
[0184] 引物：SEQIDN06 (180R2)5,-ACAACCAAACTCTAAAAACTCG-3'
[0185] 探針：SEQIDNo7 (180P14) 5,-CALFluorRed-CGTCGGAGTCGTAGCGAGTTT_BHQ2-3，
[0186] 引物：SEQIDN08 (180R135)5,-AAAACCTCCAACTTCACACCC-3，
[0187] 引物：SEQIDNo9 (180R14)5,-CGCCAACAACCAAACTCTAA-3'
[0188] 進一步，申請人