一種條件性基因敲除動物模型的快速構(gòu)建方法及應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因編輯技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種條件性基因敲除動物模型的快速 構(gòu)建方法以及其應用。
【背景技術(shù)】
[0002] CRISPR(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeat sequences)/Cas9系統(tǒng)是一種新型的基因編輯技術(shù)。該技術(shù)利用具有引導作用的 sgRNA(shortguideRNA)與基因組DNA革E1序列特異性結(jié)合，招募具有內(nèi)切酶功能的Cas9蛋 白對目標靶點進行切割。DNA雙鏈被切開后，殘端在沒有同源序列時以非同源末端連接的方 式修復或是存在同源序列時以同源重組的方式修復。修復過程會出現(xiàn)堿基缺失或增添導致 基因失活。CRIPSR/Cas9技術(shù)已實現(xiàn)果蠅、斑馬魚、小鼠、大鼠、猴、人等多個物種的基因敲 除，并廣泛應用于基因編輯的其他方面，如基因敲入、定點整合及缺失、定點突變等。相比于 其他基因編輯系統(tǒng)如TALENs，ZFNs等核酸酶技術(shù)，CRISPR/Cas9在基因組中有豐富的靶點， 設計容易，操作簡單，敲除效率高，經(jīng)濟成本低，并且能夠?qū)崿F(xiàn)多個基因同時敲除等優(yōu)點，在 基因敲除動物模型構(gòu)建以及疾病模型的構(gòu)建和治療領(lǐng)域具有非常廣泛的應用前景。
[0003] 通過顯微注射將DNA注射到小鼠受精卵中，然后移植到孕鼠的囊胚中，能發(fā)育成 轉(zhuǎn)基因的嵌合體，后代可以得到轉(zhuǎn)基因的動物，通過這種方法可以將目的基因快速導入小 鼠體內(nèi)。利用這種方法可以快速將CRISPR/Cas9系統(tǒng)整合到小鼠基因組中。
[0004] 目前條件性基因敲除動物模型主要是通過特異性重組酶系統(tǒng)Cre-LoxP(或 Flp-Frt)來實現(xiàn)的，將帶有特定flox位點的轉(zhuǎn)基因小鼠與細胞特異性表達的Cre酶的轉(zhuǎn)基 因小鼠雜交可以獲得特定組織細胞中基因敲除的小鼠。更換Cre酶的基因的啟動子可以實 現(xiàn)多種條件（如藥物誘導、特定時間、特定組織等）下基因敲除。但是這種條件性基因敲除 的方法需要同時構(gòu)建兩個轉(zhuǎn)基因小鼠（flox小鼠和Cre小鼠），而且條件性基因敲除小鼠只 能通過flox小鼠和Cre小鼠雜交而來，獲得條件性基因敲除的純合小鼠周期較長，成本較 高，操作復雜。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種簡單易行、經(jīng)濟高效、適用范圍廣的條件性基因敲除動 物模型的快速構(gòu)建方法及其應用。
[0006] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0007] 一種條件性基因敲除動物模型的快速構(gòu)建方法，其是采用CRISPR/Cas9技術(shù)完成 的。具體方法可以為：設計CRISPR/Cas9系統(tǒng)針對動物待敲除基因的gRNA靶點序列，設計 相應的啟動子，構(gòu)建質(zhì)粒，實現(xiàn)條件性基因敲除。其可以實現(xiàn)快速有效、簡單易行的條件性 基因敲除動物模型的構(gòu)建，可以解決上述傳統(tǒng)方法（特異性重組酶系統(tǒng)Cre-LoxP)的缺陷。
[0008] 根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，本發(fā)明的構(gòu)建方法可以用于小鼠骨組織特異性 Y谷氨酸羧化酶基因（GGCX)敲除小鼠模型的快速構(gòu)建。但是本領(lǐng)域技術(shù)人員都可以理解 的是，在更換GGCX的gRNA序列后，能夠同時敲除多個基因。在更換骨特異性的啟動子后， 可實現(xiàn)在其他組織中特異性的基因敲除。
[0009] 進一步地，本發(fā)明提供一種小鼠骨組織特異性Y谷氨酸羧化酶基因敲除小鼠模 型的快速構(gòu)建方法，設計CRISPR/Cas9系統(tǒng)針對小鼠GGCX基因的gRNA靶點序列，設計相 應的啟動子，構(gòu)建質(zhì)粒，實現(xiàn)GGCX基因敲除；其中CRISPR/Cas9系統(tǒng)針對小鼠GGCX基因的 gRNA靶點為兩個，其序列如SEQIDNO. 1和SEQIDNO. 2所示。所述SEQIDNO. 1和SEQ IDNO. 2分別是針對GGCX外顯子一和外顯子二的gRNA靶點。
[0010] 其中所述啟動子優(yōu)選為小鼠骨特異性Osterix啟動子，序列如SEQIDNO.19所 不〇
[0011] 其中所述CRISPR/Cas9系統(tǒng)中的Cas9質(zhì)粒，優(yōu)選包括Cas9基因及核定位信號序 列，含有如SEQIDNO. 10所不的喊基序列。
[0012] 在上述基礎上，本發(fā)明提供的最優(yōu)選的用于條件性敲除小鼠GGCX基因的質(zhì)粒， 為Posterix-Cas9-gRNAl-gRNA2,質(zhì)粒圖譜見附圖7所示。所述條件性基因敲除質(zhì)粒 Poster ix-Cas9-gRNAl-gRNA2，利用受精卵顯微注射的方法整合到小鼠基因組中，獲得條件 性基因敲除的后代。
[0013] 本發(fā)明的方法具有以下優(yōu)點：
[0014] 1、只需構(gòu)建一只轉(zhuǎn)基因小鼠就可以實現(xiàn)條件性基因敲除。避免了Cre小鼠和flox 小鼠復雜的雜交過程。
[0015] 2、構(gòu)建用于條件性基因敲除的轉(zhuǎn)基因小鼠，可實現(xiàn)在骨組織中特異性的敲除GGCX 基因。
[0016] 3、在更換GGCX的gRNA序列后，能夠同時敲除多個基因。在更換骨特異性的啟動 子后，可實現(xiàn)在其他組織中特異性的基因敲除。
[0017] 4、基因敲除周期縮短，經(jīng)濟成本顯著減小。
[0018] 利用本發(fā)明可以快速實現(xiàn)多個物種多種條件性基因敲除。獲得的條件性基因敲除 動物遺傳背景清晰，能夠穩(wěn)定遺傳，能夠廣泛應用于基因功能的研宄和各種疾病模型的構(gòu) 建。
[0019] 上述說明僅是本發(fā)明技術(shù)方案的概述，為了能夠更清楚了解本發(fā)明的技術(shù)手段， 并可依照說明書的內(nèi)容予以實施，以下以本發(fā)明的較佳實施例并配合附圖詳細說明如后。
【附圖說明】
[0020] 圖1是CRISPR/Cas9系統(tǒng)針對GGCX靶點序列及位置示意圖，大寫為外顯子序列， 小寫為內(nèi)含子序列；
[0021] 圖2是gRNA活性驗證測序峰圖；
[0022] 圖3是三個CMV-Cas9_gRNA質(zhì)粒示意圖；
[0023] 圖4是三個CMV-Cas9_gRNA質(zhì)?；钚则炞C測序峰圖；
[0024] 圖5是三個CMV-Cas9_gRNA質(zhì)粒剪切電泳圖；
[0025] 圖6是三個CMV-Cas9_gRNA質(zhì)粒剪切測序圖；
[0026] 圖7是0SX-Cas9-gRNAl-gRNA2質(zhì)粒圖譜；
[0027]圖8是0SX-Cas9_gRNA質(zhì)粒剪切測序圖；
[0028] 圖9是轉(zhuǎn)基因OSX-Cas9_gRNA質(zhì)粒線性化電泳圖；
[0029] 圖10是OSX-Cas9_gRNA轉(zhuǎn)基因小鼠鑒定圖；
[0030] 圖11是OSX-Cas9-gRNA轉(zhuǎn)基因小鼠骨GGCX敲除電泳鑒定圖；
[0031] 圖12是OSX-Cas9-gRNA轉(zhuǎn)基因小鼠骨GGCX敲除測序鑒定分析圖。
【具體實施方式】
[0032] 下面結(jié)合附圖和實施例，對本發(fā)明的【具體實施方式】作進一步詳細描述。以下實施 例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0033] 所涉及的化學試劑或生物制品，如未特別說明都為商業(yè)化產(chǎn)品。另外，其他未注明 的實驗操作按照常規(guī)分子生物學操作方法進行。
[0034] 實施例1
[0035] 針對小鼠GGCX設計gRNA靶點
[0036] 參照gRNA設計原則，針對Y谷氨酸羧化酶（GGCX)第一個和第二個外顯子分別設 計gRNAl和gRNA2祀點，序列如下所示：
[0037] gRNA靶點1 :GAGCAACCAGTGCGGAGCCG(如SEQ ID NO. 1所示）
[0038] gRNA靶點2 :GCCAGGITTGCAGGGTCCGT(如SEQ ID NO. 2所示）
[0039] 詳細信息如圖1所示。
[0040] 構(gòu)建gRNA載體
[0041] 1、gRNA空載體酶切
[0042] gRNA空載體從addgene公司購買。gRNA空載體連在pCR?-_Blunt II-TOPO? 載體中。使用Afl II酶（NEB)酶切，膠回收酶切片段一。
[0043] gRNA空載體序列：如SEQ ID NO. 3所示。
[0044] 2、構(gòu)建gRNA靶點序列插入片段
[0045] 1)設計引物序列如下：
[0046] gRNAl上游引物gRNAl-F(如SEQ ID NO. 4所示）：
[0047] 5' -TTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGAGCAA CCAGTGCGGAGCCG-3'
[0048] gRNAl下游引物gRNAl-R(如SEQ ID NO. 5所示）：
[0049] 5' -GACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAACCGGCTCC GCACTGGTTGCT-3'
[0050] gRNA2上游引物gRNA2-F(如SEQ ID NO. 6所示）：
[0051] 5' -TTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGCCAGGT TTGCAGGGTCCGT-3'
[005