I酶切位點。
[0115] 設計引物序列如下
[0116]Posterix-F(如SEQIDNO. 17 所示）：
[0117] AGCACGCGTCCTCAGTCCTGCTTGCCTTA
[0118]Posterix-R(如SEQIDNO. 18 所示）
[0119]GCTGCTAGCAGAGAACCGAGGAGCCAGT：
[0120] PCR反應體系：pfu酶（康為世紀）25yl，上游引物Posterix-F(10uM)2.5yl，下 游引物P〇sterix-R(10uM)2. 5y1，小鼠基因組DNA100ng，加水至 50y1。
[0121] PCR反應條件：預變性94°C5min，變性94°C30秒，退火55°C30秒，延伸72°C30 秒，重復30個循環(huán)，終延伸72°C3分。
[0122] 膠回收回收2000bp左右的條帶，使用MluI內(nèi)切酶（NEB)和NheI內(nèi)切酶（NEB) 酶切片段，膠回收試劑盒回收片段九。
[0123]Osterix啟動子序列：如SEQIDNO. 19 所示。
[0124] 2、使用MluI內(nèi)切酶和NheI內(nèi)切酶酶切CMV-Cas9-gRNAl-gRNA2質(zhì)粒，膠回收試 劑盒回收l〇〇〇〇bp左右的片段十。
[0125] 3、將片段九和片段十按照摩爾比1 :10的比例混合用T4連接酶連接。具體操作步 驟參考試劑盒說明書。將連接產(chǎn)物轉化DH5a大腸桿菌（康為世紀），在含有AMP(100yg/ ml)的平板尚均勻涂布，12小時后PCR篩選陽性克隆菌，挑取克隆，37°C搖菌16小時，抽提 質(zhì)粒。
[0126] 4、測序證實0SX-Cas9-gRNAl-gRNA2質(zhì)粒序列正確。質(zhì)粒圖譜信息見附圖7。
[0127]七、驗證0SX-Cas9-gRNAl_gRNA2活性
[0128] 1、將 0SX-Cas9-gRNAl-gRNA2 轉染到MC3T3-E1 中，24 小時加入 1000ng/ml濃度的 G418篩選，72小時后收集剩余的活細胞，提取基因組DNA。
[0129] 2、使用GGCX-F和GGCX-R引物PCR擴增包含靶點的片段，將PCR產(chǎn)物回收，連接到 pMd-20T載體中，涂布在含有AMP(100yg/ml)，X-gal(20mg/ml)，ITPG(lmM)瓊脂糖平板上 培養(yǎng)16小時，挑取20個白色克隆搖菌。37°C搖菌16小時，抽提質(zhì)粒。
[0130] 3、質(zhì)粒送公司測序，測序結果顯示靶點位置DNA發(fā)生剪切。詳細信息見附圖8。
[0131] 構建條件性基因敲除小鼠
[0132] 1、線性化OSX-Cas9-gRNAl_gRNA2
[0133] 使用BglI單酶切OSX-Cas9-gRNAl-gRNA2,酶切后膠回收片段^^一。酶切鑒定圖 見附圖9。
[0134] DNA顯微注射構建轉基因小鼠
[0135] 線性化的OSX-Cas9-gRNAl-gRNA2質(zhì)粒由中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研宄所研 宄所通過DNA顯微注射受精卵的方法獲得轉入OSX-Cas9-gRNAl-gRNA2的4只轉基因小鼠。
[0136] 轉基因小鼠驗證
[0137] 無菌條件下剪取4只轉基因小鼠后肢腳趾，將皮膚和趾骨分離干凈，分別提取皮 膚和趾骨基因組DNA，PCR擴增Cas9基因和gRNA基因。
[0138] 設計引物如下
[0139] Cas9jc_F(如SEQIDNO. 20 所示）：
[0140] 5'-AGGCTGACTTGCGGTTGA-3'
[0141] Cas9jc-R(如SEQIDNO. 21 所示）：
[0142] 5'-CCGAGTGACAGGGCGATA-3'
[0143]gRNAjc-F(如SEQIDNO. 22 所示）：
[0144] 5'-AGGCTAGTCCGTTATCAA-3'
[0145]gRNAjc-R(如SEQIDNO. 23 所示）：
[0146] 5'-TGTACAAGAAAGCTGGGT-3'
[0147] PCR反應體系：ESTaqmaterMix10y1，Cas9jc-F引物 1y1，Cas9jc-R引物 1y1 (或gRNAjc-F引物1y1，gRNAjc-R引物1y1)，趾骨基因組DNA模板100ng，dH20補至 20yl〇
[0148]PCR反應條件：預變形94°C5分，變形94°C30秒，退火55°C30秒，延伸72°C1分， 35個循環(huán)，終延伸72°C5分。
[0149] 電泳圖可見四只轉基因陽性小鼠都檢測到條帶，兩只陰性對照組則沒有，結果表 明0SX-Cas9-gRNAl-gRNA2轉基因小鼠構建成功。詳細信息見附圖10。
[0150] 4、條件性基因敲除小鼠驗證
[0151]PCR分別擴增轉基因小鼠皮膚和趾骨基因組DNA的GGCX靶點片段，具體方法參照 上述實驗過程，檢測到4只轉基因小鼠趾骨基因組DNA能擴增出900bp大小條帶，同時在 500bp左右也出現(xiàn)條帶，而陰性對照組和皮膚中沒有檢測到500bp左右的條帶。詳細信息附 圖11。
[0152] 將Founder3小鼠趾骨PCR產(chǎn)物回收后，連接到pMD-20-T載體中，涂布在含有 AMP(100yg/ml)，X-gal(20mg/ml)，ITPG(lmM)瓊脂糖平板上培養(yǎng)16小時，挑取至少10個 白色克隆搖菌。37°C搖菌16小時，抽提質(zhì)粒。將質(zhì)粒送公司測序，測序結果顯示靶點位置 DNA發(fā)生剪切。詳細信息見附圖12。
[0153]通過轉基因技術構建條件性敲除質(zhì)粒0SX-Cas9-gRNAl-gRNA2轉基因小鼠，在轉 基因小鼠骨中檢測到特定靶點發(fā)生缺失突變，而皮膚中沒有發(fā)生。單克隆測序結果確認了 特定靶點DNA發(fā)生缺失突變，由此證明利用CRISPR/Cas9技術快速構建條件性基因敲除動 物模型成功實現(xiàn)。這種方法構建的小鼠生長狀態(tài)和繁殖能力沒有受到影響。
[0154] 以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，并不用于限制本發(fā)明，應當指出，對于本技 術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明技術原理的前提下，還可以做出若干改進和 變型，這些改進和變型也應視為本發(fā)明的保護范圍。
[0155]
【主權項】
1. 一種條件性基因敲除動物模型的快速構建方法，其特征在于：采用CRISPR/Cas9技 術。
2. 根據(jù)權利要求1所述的快速構建方法，其特征在于：設計CRISPR/Cas9系統(tǒng)針對動 物待敲除基因的gRNA革El點序列，設計相應的啟動子，構建質(zhì)粒，實現(xiàn)條件性基因敲除。
3. 權利要求2所述的快速構建方法在小鼠骨組織特異性Y谷氨酸羧化酶基因敲除小 鼠模型中的應用。
4. 一種小鼠骨組織特異性Y谷氨酸羧化酶基因敲除小鼠模型的快速構建方法，其特 征在于：設計CRISPR/Cas9系統(tǒng)針對小鼠GGCX基因的gRNA靶點序列，設計相應的啟動子， 構建質(zhì)粒，實現(xiàn)GGCX基因敲除；其中CRISPR/Cas9系統(tǒng)針對小鼠GGCX基因的gRNA靶點為 兩個，其序列如SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示。
5. 根據(jù)權利要求4所述的快速構建方法，其特征在于：所述SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2分別是針對GGCX外顯子一和外顯子二的gRNA靶點。
6. 根據(jù)權利要求5所述的快速構建方法，其特征在于：所述啟動子為小鼠骨特異性 Osterix啟動子，序列如SEQ ID NO. 19所示。
7. 根據(jù)權利要求6所述的快速構建方法，其特征在于：所述CRISPR/Cas9系統(tǒng)中的 Cas9質(zhì)粒，包括Cas9基因及核定位信號序列，含有如SEQ ID NO. 10所示的堿基序列。
8. 根據(jù)權利要求7所述的快速構建方法構建得到的用于條件性敲除小鼠GGCX基因的 質(zhì)粒，其特征在于：為P〇sterix-Cas9-gRNAl-gRNA2,質(zhì)粒圖譜見附圖7所示。
9. 權利要求8所述的質(zhì)粒在快速構建骨特異性GGCX基因敲除小鼠模型中的應用。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種條件性基因敲除動物模型的快速構建方法，其是采用CRISPR/Cas9技術完成的。具體方法可以為：設計CRISPR/Cas9系統(tǒng)針對動物待敲除基因的gRNA靶點序列，設計相應的啟動子，構建質(zhì)粒，實現(xiàn)條件性基因敲除。其可以實現(xiàn)快速有效、簡單易行、經(jīng)濟高效、適用范圍廣的條件性基因敲除動物模型的構建，可以解決上述傳統(tǒng)方法(特異性重組酶系統(tǒng)Cre-LoxP)的缺陷。
【IPC分類】A01K67-027, C12N15-85
【公開號】CN104745626
【申請?zhí)枴緾N201410802935
【發(fā)明人】戴鐘銓, 梁培龍, 曹宏卿, 吳峰, 楊超, 張洪玉, 李金橋, 陳鍵, 萬玉民, 李瑩輝
【申請人】中國航天員科研訓練中心
【公開日】2015年7月1日
【申請日】2014年12月19日