一種新型造血干細(xì)胞檢測試劑制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種新型的造血干細(xì)胞檢測試劑制備方法和應(yīng)用，具體的說是涉及人和鼠的造血干細(xì)胞檢測試劑的制備方法。
技術(shù)背景:
[0002]造血干細(xì)胞具有自我更新和定向分化的兩大功能。造血干細(xì)胞在體內(nèi)定向分化為粒系祖細(xì)胞、紅系祖細(xì)胞、淋巴系祖細(xì)胞、巨核祖細(xì)胞，粒系祖細(xì)胞又進(jìn)一步分化為粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞，發(fā)揮免疫和抗細(xì)菌感染作用；淋巴系祖細(xì)胞分化為淋巴細(xì)胞，發(fā)揮免疫和抗病毒感染作用；紅系祖細(xì)胞分化為紅細(xì)胞，發(fā)揮輸送氧氣，排出二氧化碳的功能，巨核祖細(xì)胞分化為血小板，發(fā)揮抗凝血功能，從而實(shí)現(xiàn)造血。
[0003]在人體中，造血干細(xì)胞存在于骨髓，當(dāng)造血干細(xì)胞發(fā)生病理性數(shù)量減少時(shí)，粒系祖細(xì)胞、紅系祖細(xì)胞、淋巴系祖細(xì)胞、巨核祖細(xì)胞就會(huì)減少，血液中白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血小板也會(huì)減少，人體就會(huì)患再生障礙性貧血。
[0004]造血干細(xì)胞移植是治療白血病、再生障礙性貧血等疾病的有效方法。造血干細(xì)胞移植需要對造血干細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行檢測，以確保人體獲得足夠數(shù)量的造血干細(xì)胞，保證移植獲得成功。
[0005]在體外，只要提供合適的造血干細(xì)胞生長條件，即造血干細(xì)胞培養(yǎng)基，造血干細(xì)胞可以分化成粒單系造血細(xì)胞集落和紅系造血細(xì)胞集落，粒單系造血細(xì)胞集落中含有造血干細(xì)胞分化的粒系造血祖細(xì)胞、粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞；紅系造血細(xì)胞集落中含有紅系造血祖細(xì)胞、紅細(xì)胞。根據(jù)集落數(shù)量，測定造血干細(xì)胞的數(shù)量。

【發(fā)明內(nèi)容】

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[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種造血干細(xì)胞活性檢測的方法。
[0007]一種新型的造血干細(xì)胞培養(yǎng)基試劑，是由下述步驟組成:
[0008]1.稱取甲基纖維素11克，加入煮沸的250mL去離子水中，用加熱磁力攪拌器不斷的攪拌，使之充分混勻，繼續(xù)煮沸15-30分鐘后，將瓶取下，于室溫中冷卻至37°C。
[0009]2.于步驟(I)中加入頂01(2父)2501^，并反復(fù)振蕩200次，使之充分混勻后置41:冰箱中，2小時(shí)后，置_20°C冰箱凍結(jié)，24小時(shí)后取出，于室溫中融化，分裝，置4°C冰箱中保存。
[0010]3.稱取BSAlOOg，加入去離子水440mL，混勻，4°C過夜，次日補(bǔ)充去離子水至500mL，加入AG501 (D) 20-50篩孔離子交換樹脂15g，4 °C下輕輕攪拌直到樹脂完全變色，再加離子交換樹脂15g，4°C下攪拌過夜。如果部分樹脂保留藍(lán)色，表BSA完全去離子，倘若不見藍(lán)色樹脂，需再加離子交換樹脂15g，繼續(xù)攪拌過夜，過濾去除離子交換樹脂，然后100rpm / min,離心30分鐘，測體積，再加等體積2X IMDM混勻，無菌過濾，分裝1mL /管，_20°C凍存?zhèn)溆谩?br>[0011]4.在離心管中依次加入胎牛血清3mL，10% BSA1.5mL, 100uL2_ME，10uL重組人干細(xì)胞生長因子，10uL重組人粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子，10uL重組人白細(xì)胞介素3，最后加入步驟(2)配置的甲基纖維素5.lmL，充分混勻，-20°C凍存，次日取出，于室溫中融化，分裝，4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0012]至此，一種新型的造血干細(xì)胞檢測試劑制備已經(jīng)完成。
[0013]上述全部過程均在無菌環(huán)境中進(jìn)行操作。
[0014]實(shí)施例1
[0015]1.稱取甲基纖維素11克，加入煮沸的250mL去離子水中，用加熱磁力攪拌器不斷的攪拌，使之充分混勻，繼續(xù)煮沸15-30分鐘后，將瓶取下，于室溫中冷卻至37°C。
[0016]2.于步驟(I)中加入頂01(2父)2501^，并反復(fù)振蕩200次，使之充分混勻后置41:冰箱中，2小時(shí)后，置_20°C冰箱凍結(jié)，24小時(shí)后取出，于室溫中融化，分裝，置4°C冰箱中保存。
[0017]3.稱取BSAlOOg，加入去離子水440mL，混勻，4°C過夜，次日補(bǔ)充去離子水至500mL，加入AG501 (D) 20-50篩孔離子交換樹脂15g，4 °C下輕輕攪拌直到樹脂完全變色，再加離子交換樹脂15g，4°C下攪拌過夜。如果部分樹脂保留藍(lán)色，表BSA完全去離子，倘若不見藍(lán)色樹脂，需再加離子交換樹脂15g，繼續(xù)攪拌過夜，過濾去除離子交換樹脂，然后100rpm / min,離心30分鐘，測體積，再加等體積2X IMDM混勻，無菌過濾，分裝1mL /管，-20°C凍存?zhèn)溆谩?br>[0018]4.在離心管中依次加入胎牛血清3mL，10% BSA1.5mL, 100uL2_ME，10uL重組人干細(xì)胞生長因子，10uL重組人粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子，10uL重組人白細(xì)胞介素3，最后加入步驟(2)配置的甲基纖維素5.lmL，充分混勻，-20°C凍存，次日取出，于室溫中融化，分裝，4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0019]制備的造血干細(xì)胞檢測試劑檢測人(或鼠)骨髓造血干細(xì)胞:
[0020]1.骨髓造血干細(xì)胞制備:取淋巴細(xì)胞分離液(比重1.077) 3mL，于離心管中，取骨髓液3mL，加入3mLPBS，充分混勻，將充分混勻的骨髓液輕輕的加入淋巴細(xì)胞分離液表面，2000rpmX20min,離心，骨髓細(xì)胞分層，上層為血漿，下層為紅細(xì)胞，中間層白膜層富含造血干細(xì)胞，取中間白膜層放置于1mLPBS中，離心100rpmX 1min,洗滌2次，骨髓造血干細(xì)胞沉淀于試管底部，去除上清液，加入20%胎牛血清，調(diào)整細(xì)胞數(shù)至IXlO6 / mL，備用。
[0021]2.取10uL骨髓造血干細(xì)胞(IXlO5細(xì)胞)懸液于試管中，加入甲基纖維素，充分混勻后，將含有骨髓造血干細(xì)胞的甲基纖維素放置于細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置于37°C，5 %的C02培養(yǎng)箱中濕度培養(yǎng)7天，倒置顯微鏡下，觀察結(jié)果。
[0022]3.集落計(jì)數(shù):
[0023]采用OLympus CKX41倒置式顯微鏡，目鏡10X，分別采用物鏡4X、1X和20X觀察，采用物鏡4X集落計(jì)數(shù)。
[0024]CFU-GM:細(xì)胞數(shù)量大于40個(gè)的細(xì)胞團(tuán)為集落。其形態(tài)分3種，a.致密型:細(xì)胞緊密成團(tuán)，細(xì)胞個(gè)體較小，是以粒細(xì)胞為主。b.混合型:細(xì)胞團(tuán)中央為聚集的粒細(xì)胞，周圍彌散分布單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞。C.疏散型:細(xì)胞團(tuán)比較均勻分散，細(xì)胞個(gè)體較大，多由單核巨噬細(xì)胞組成。CFU-E、BFU-E:呈粉紅色/暗紅色/橙色，CFU-E含1_2個(gè)細(xì)胞族，有8-200個(gè)細(xì)胞，BFU-E為2個(gè)以上細(xì)胞族，至少含200個(gè)細(xì)胞。CFU-GEMM:至少含50個(gè)細(xì)胞，多為粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，巨核細(xì)胞和有核紅細(xì)胞數(shù)量不定。正常情況下，I X 15骨髓造血干細(xì)胞中含有CFU-GM大約70-80個(gè)集落，含有CFU-E和BFU-E集落60-70個(gè)，含有CFU-GEMM集落5_7個(gè)。
[0025]實(shí)施例2
[0026]1.稱取甲基纖維素11克，加入煮沸的250mL去離子水中，用加熱磁力攪拌器不斷的攪拌，使之充分混勻，繼續(xù)煮沸15-30分鐘后，將瓶取下，于室溫中冷卻至37°C。
[0027]2.于步驟(I)中加入RPMI1640(2X)250mL，并反復(fù)振蕩200次，使之充分混勻后置4°C冰箱中，2小時(shí)后,置-20°C冰箱凍結(jié),24小時(shí)后取出，于室溫中融化,分裝,置4°C冰箱中保存。
[0028]3.稱取BSAlOOg，加入去離子水440mL，混勻，4°C過夜，次日補(bǔ)充去離子水至500mL，加入AG501 (D) 20-50篩孔離子交換樹脂15g，4 °C下輕輕攪拌直到樹脂完全變色，再加離子交換樹脂15g，4°C下攪拌過夜。如果部分樹脂保留藍(lán)色，表BSA完全去離子，倘若不見藍(lán)色樹脂，需再加離子交換樹脂15g，繼續(xù)攪拌過夜，過濾去除離子交換樹脂，然后100rpm / min,離心30分鐘,