測體積，再加等體積2XRPMI1640混勻，無菌過濾,分裝1mL /管，-20°C凍存?zhèn)溆谩?br>[0029]4.在離心管中依次加入胎牛血清3mL，10% BSA1.5mL, 100uL2_ME，10uL重組人干細胞生長因子，10uL重組人巨噬細胞集落刺激因子，10uL重組人白細胞介素5,最后加入步驟(2)配置的甲基纖維素5.lmL，充分混勻，-20°C凍存，次日取出，于室溫中融化，分裝，4 °C保存?zhèn)溆谩?br>[0030]制備的造血干細胞檢測試劑檢測人外周血造血干細胞:
[0031]1.外周血造血干細胞制備:取淋巴細胞分離液(比重1.077) 3mL，于離心管中，取外周血3mL，加入3mLPBS,充分混勻，將充分混勻的外周血液輕輕的加入淋巴細胞分離液表面，2000rpmX20min,離心，外周血細胞分層，上層為血漿，下層為紅細胞，中間層白膜層富含造血干細胞，取中間白膜層放置于1mLPBS中，離心100rpmX 1min,洗滌2次，外周血造血干細胞沉淀于試管底部，去除上清液，加入20%胎牛血清，調(diào)整細胞數(shù)至IXlO6 / mL，備用。
[0032]2.取10uL外周血造血干細胞(I X 15細胞)懸液于試管中，加入甲基纖維素，充分混勻后，將含有外周血造血干細胞的甲基纖維素放置于細胞培養(yǎng)皿中，置于37°C，5 %的C02培養(yǎng)箱中濕度培養(yǎng)7天，倒置顯微鏡下，觀察結果。
[0033]3.集落計數(shù):采用OLympus CKX41倒置式顯微鏡，目鏡10X，分別采用物鏡4X、1X和20X觀察，采用物鏡4X集落計數(shù)。
[0034]CFU-GM:細胞數(shù)量大于40個的細胞團為集落。其形態(tài)分3種，a.致密型:細胞緊密成團，細胞個體較小，是以粒細胞為主。b.混合型:細胞團中央為聚集的粒細胞，周圍彌散分布單核細胞或巨噬細胞。C.疏散型:細胞團比較均勻分散，細胞個體較大，多由單核巨噬細胞組成。CFU-E、BFU-E:呈粉紅色/暗紅色/橙色，CFU-E含1_2個細胞族，有8-200個細胞，BFU-E為2個以上細胞族，至少含200個細胞。CFU-GEMM:至少含50個細胞，多為粒細胞和巨噬細胞，巨核細胞和有核紅細胞數(shù)量不定。
[0035]實施例3
[0036]1.稱取甲基纖維素11克，加入煮沸的250mL去離子水中，用加熱磁力攪拌器不斷的攪拌，使之充分混勻，繼續(xù)煮沸15-30分鐘后，將瓶取下，于室溫中冷卻至37°C。
[0037]2.于步驟⑴中加入01^1(2父)2501^，并反復振蕩200次，使之充分混勻后置41:冰箱中，2小時后，置_20°C冰箱凍結，24小時后取出，于室溫中融化，分裝，置4°C冰箱中保存。
[0038]3.稱取BSAlOOg，加入去離子水440mL，混勻，4°C過夜，次日補充去離子水至500mL，加入AG501 (D) 20-50篩孔離子交換樹脂15g，4 °C下輕輕攪拌直到樹脂完全變色，再加離子交換樹脂15g，4°C下攪拌過夜。如果部分樹脂保留藍色，表BSA完全去離子，倘若不見藍色樹脂，需再加離子交換樹脂15g，繼續(xù)攪拌過夜，過濾去除離子交換樹脂，然后100rpm / min,離心30分鐘,測體積，再加等體積2XDMEM混勻，無菌過濾,分裝1mL /管，_20°C凍存?zhèn)溆谩?br>[0039]4.在離心管中依次加入胎牛血清3mL，10% BSA1.5mL, 100uL2_ME，10uL重組人干細胞生長因子，10uL重組人巨噬細胞集落刺激因子，10uL重組人白細胞介素5，促人紅細胞生成素10ug，最后加入步驟(2)配置的甲基纖維素5.lmL，充分混勻，_20°C凍存，次日取出，于室溫中融化，分裝，4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0040]制備的造血干細胞檢測試劑檢測人臍帶血造血干細胞:
[0041]1.臍帶血造血干細胞制備:取淋巴細胞分離液(比重1.077) 3mL，于離心管中，取臍帶血3mL，加入3mLPBS，充分混勻，將充分混勻的臍帶血液輕輕的加入淋巴細胞分離液表面，2000rpmX20min,尚心，胳市血細胞分層，上層為血衆(zhòng)，下層為紅細胞，中間層白I旲層ι?含造血干細胞，取中間白膜層放置于1mLPBS中，離心100rpmX 1min,洗滌2次，臍帶血造血干細胞沉淀于試管底部，去除上清液，加入20%胎牛血清，調(diào)整細胞數(shù)至IXlO6 / mL，備用。
[0042]2.取10uL臍帶血造血干細胞(I X 15細胞)懸液于試管中，加入甲基纖維素，充分混勻后，將含有臍帶血造血干細胞的甲基纖維素放置于細胞培養(yǎng)皿中，置于37°C，5 %的C02培養(yǎng)箱中濕度培養(yǎng)7天，倒置顯微鏡下，觀察結果。
[0043]3.集落計數(shù):
[0044]采用OLympus CKX41倒置式顯微鏡，目鏡10X，分別采用物鏡4X、1X和20X觀察，采用物鏡4X集落計數(shù)。
[0045]CFU-GM:細胞數(shù)量大于40個的細胞團為集落。其形態(tài)分3種，a.致密型:細胞緊密成團，細胞個體較小，是以粒細胞為主。b.混合型:細胞團中央為聚集的粒細胞，周圍彌散分布單核細胞或巨噬細胞。C.疏散型:細胞團比較均勻分散，細胞個體較大，多由單核巨噬細胞組成。CFU-E、BFU-E:呈粉紅色/暗紅色/橙色，CFU-E含1_2個細胞族，有8-200個細胞，BFU-E為2個以上細胞族，至少含200個細胞。CFU-GEMM:至少含50個細胞，多為粒細胞和巨噬細胞，巨核細胞和有核紅細胞數(shù)量不定。
【主權項】
1.一種新型的造血干細胞檢測試劑，其特征在于，是由下述步驟組成: 1.稱取甲基纖維素11克，加入煮沸的250mL去離子水中，用加熱磁力攪拌器不斷的攪拌，使之充分混勻，繼續(xù)煮沸15-30分鐘后，將瓶取下，于室溫中冷卻至37 °C。
2.于步驟(I)中加入MDM(2 X )250mL，并反復振蕩200次，使之充分混勻后置4°C冰箱中，2小時后，置-20 0C冰箱凍結，24小時后取出，于室溫中融化，分裝，置40C冰箱中保存。
3.稱取BSAlOOg，加入去離子水440mL，混勻，4°C過夜，次日補充去離子水至500mL，加AAG501(D)20-50篩孔離子交換樹脂15g，4°C下輕輕攪拌直到樹脂完全變色，再加離子交換樹脂15g，4°C下攪拌過夜。如果部分樹脂保留藍色，表BSA完全去離子，倘若不見藍色樹月旨，需再加離子交換樹脂15g，繼續(xù)攪拌過夜，過濾去除離子交換樹脂，然后100rpm / min,離心30分鐘，測體積，再加等體積2X MDM混勻，無菌過濾，分裝1mL /管，-20°C凍存?zhèn)溆谩?br>4.在離心管中依次加入胎牛血清3mL，10%BSA1.5mL, 100uL2_ME，10uL重組人干細胞生長因子，10uL重組人粒-巨噬細胞集落刺激因子，10uL重組人白細胞介素3，最后加入步驟(2)配置的甲基纖維素5.lmL，充分混勻，-20°C凍存，次日取出，于室溫中融化，分裝，4 °C保存?zhèn)溆谩?br>【專利摘要】本發(fā)明公開了一種新型造血干細胞檢測試劑制備方法和應用。所述制備方法，包括：溶解甲基纖維素，依次按照比例加入IMDM培養(yǎng)基、胎牛血清、經(jīng)過離子交換樹脂處理的牛血清白蛋白、2-ME、重組人干細胞生長因子、重組人粒-巨噬細胞集落刺激因子、重組人白細胞介素3。本發(fā)明獲得的造血干細胞檢測試劑可以檢測人和小鼠骨髓、外周血、臍帶血中的造血干細胞數(shù)量，富有應用前景。
【IPC分類】C12Q1-02
【公開號】CN104745668
【申請?zhí)枴緾N201410017886
【發(fā)明人】李春艷
【申請人】上海吉泉生物技術有限公司
【公開日】2015年7月1日
【申請日】2014年1月15日