雞傳染性法氏囊病病毒抗原的制備方法及其制品的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及雞傳染性法氏囊病病毒抗原，尤其涉及利用家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)在 昆蟲體內(nèi)表達(dá)傳染性法氏囊病病毒抗原的方法及其制品，本發(fā)明還涉及利用桿狀病毒表達(dá) 系統(tǒng)在家蠶生物反應(yīng)器中制備雞傳染性法氏囊病核酸疫苗的方法，屬于雞傳染性法氏囊病 病毒抗原及核酸疫苗的制備領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 雞傳染性法氏囊?。↖nfectious bursal disease，IBD)是由傳染性法氏囊病病毒 (Infectious bursal disease virus，IBDV)引起的一種急性接觸傳染性疾病。
[0003]目前，預(yù)防IBD的主要疫苗為弱毒苗和滅活苗。但是，隨著IBDV變異株和超強毒 株的出現(xiàn)，經(jīng)常導(dǎo)致免疫失敗，因此開發(fā)新的疫苗成為必然。在過去的幾十年，許多研宄人 員已經(jīng)利用大腸桿菌、禽痘病毒、重組火雞皰瘆病毒（HVT)、畢赤酵母、植物等多種表達(dá)系統(tǒng) 研制基因工程疫苗。但是當(dāng)前應(yīng)用這些表達(dá)系統(tǒng)存在一些缺陷，其中大腸桿菌表達(dá)的VP2 蛋白多以包涵體形式存在，不可溶，必須經(jīng)過變性復(fù)性，但I(xiàn)BDV核衣殼蛋白的抗原表位具 有構(gòu)像依賴性，變性的結(jié)構(gòu)蛋白對雞沒有保護(hù)性，變性再復(fù)性的VP2也失去了誘導(dǎo)雞產(chǎn)生 中和抗體的能力。重組活載體疫苗不但存在實驗室和生產(chǎn)過程中的安全問題，與普通活疫 苗一樣發(fā)生基因突變、重組的幾率也相對較高。利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)IBDV疫苗，其表達(dá)量 不高，實驗操作過程繁瑣。因此，選擇一種合適的表達(dá)系統(tǒng)研制高效、安全、經(jīng)濟的新型IBD 疫苗成為研宄人員共同努力的方向。
[0004] 桿狀病毒是已知昆蟲病毒中最大的類群，發(fā)現(xiàn)最早、研宄最多、實用性最強的昆蟲 病毒。昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)（Baculovirus expression vector system, BEVS)自 1983年問世以來（Smith et al.，1983)，由于其具有高效表達(dá)、安全、易操作等特點，已經(jīng)成 為研宄和生產(chǎn)各種原核、真核蛋白的有力工具。
[0005] 因此，利用家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)在昆蟲體內(nèi)安全、高效的表達(dá)傳染性法氏囊病 病毒抗原以及制備傳染性法氏囊病核酸疫苗，將為雞傳染性法氏囊病新的基因工程疫苗的 生產(chǎn)奠定良好的基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種利用家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)在昆蟲體內(nèi) 高效的表達(dá)雞傳染性法氏囊病病毒抗原以及制備雞傳染性法氏囊病核酸疫苗的方法。
[0007] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：
[0008] 本發(fā)明首先公開了優(yōu)化后的雞傳染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus)VP2/4/3 多聚蛋白基因，其核苷酸序列為 SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.5、SEQ ID NO. 6 或 SEQ ID NO. 7 所示；
[0009] 優(yōu)化后的雞傳染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus)VP2基因， 其核苷酸序列為SEQ ID NO. 4所示。
[0010] 本發(fā)明分析了近些年流行的 24 條 IBDV(Infectious bursal disease virus)毒 株的多聚蛋白序列，利用OptimumGene?技術(shù)對VP2/4/3蛋白基因序列進(jìn)行優(yōu)化，根據(jù)生物 反應(yīng)器家蠶的密碼子偏好性對基因序列進(jìn)行改造，對影響基因轉(zhuǎn)錄效率、翻譯效率和蛋白 折疊的GC含量、CpG二核苷酸含量、密碼子偏好性、mRNA的二級結(jié)構(gòu)、mRNA自由能穩(wěn)定性、 RNA不穩(wěn)定性基因序列、重復(fù)序列等多種相關(guān)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計，并保持最終翻譯成的蛋白 序列不變，共獲得4條優(yōu)化后的序列，其核苷酸序列分別為SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 6 或 SEQ ID NO. 7 所示。
[0011] 本發(fā)明優(yōu)化獲得的SEQ ID NO. 3所示序列，使密碼子適應(yīng)指數(shù)（Condon Adaption Index，CAI)由原來的0.84變成0.87 ;基因序列的GC含量降低，由原來的53. 72 %變成 50. 51%，使多聚蛋白基因在家蠶中的轉(zhuǎn)錄效率與翻譯效率有了較大的提高。為了提高在家 蠶桿狀病毒真核表達(dá)體系中的翻譯起始效率，在基因前面加了 Kozak序列AAC，將終止密碼 子改為TAA，提高了翻譯終止效率。此外，去除了基因序列內(nèi)部的BamH I、EcoR I、Sma I 等限制性酶切位點，在基因上游加上了 EcoR I和BamH I，在基因下游加上了 Pst I限制 性酶切位點，以便后續(xù)克隆到真核轉(zhuǎn)移載體中。
[0012] 本發(fā)明將優(yōu)化后的VP2/4/3-0基因序列（SEQ ID NO. 3所示）在家蠶生物反應(yīng) 器中進(jìn)行可溶性表達(dá)，ELISA檢測表明，優(yōu)化后的VP2/4/3-0基因在家蠶中表達(dá)量高比 IBDV-VP2/4/3基因原始序列在家蠶中表達(dá)量高出2-3倍，在6400倍稀釋甚至更高稀釋度 下仍能檢測到抗原與抗體的特異性反應(yīng)。對優(yōu)化后的SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 6、SEQ ID NO. 7所示序列進(jìn)行相同的基因操作，均獲得了在蠶體內(nèi)或蛹內(nèi)擴增，但表達(dá)效率均低于SEQ ID NO. 3所示序列。
[0013] 本發(fā)明以優(yōu)化的VP2/4/3-0基因序列為模板，擴增VP2-0基因（SEQ ID NO. 4所 示）并在家蠶生物反應(yīng)器中進(jìn)行表達(dá)，ELISA檢測結(jié)果表明，在3200倍稀釋甚至更高稀釋 度下仍能檢測到抗原與抗體的特異性反應(yīng)，表明VP2-0基因在家蠶中的表達(dá)量比原始序列 在家蠶中的表達(dá)量要高。
[0014] 本發(fā)明還公開了含有所述優(yōu)化后的雞傳染性法氏囊病病毒VP2/4/3多聚蛋白基 因或所述優(yōu)化后的雞傳染性法氏囊病病毒VP2基因的表達(dá)載體以及含有所述表達(dá)載體的 宿主或宿主細(xì)胞。
[0015] 本發(fā)明進(jìn)一步公開了一種雞傳染性法氏囊病病毒抗原的制備方法，包括以下步 驟：
[0016] (1)分別將雞傳染性法氏囊病病毒原始VP2/4/3多聚蛋白基因、原始VP2基因、優(yōu) 化后的雞傳染性法氏囊病病毒VP2/4/3多聚蛋白基因或優(yōu)化后的雞傳染性法氏囊病病毒 VP2基因克隆到桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體中，構(gòu)建得到重組轉(zhuǎn)移載體；
[0017] (2)將重組轉(zhuǎn)移載體與桿狀病毒DNA共轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞，獲得重組桿狀病毒；
[0018] (3)將重組桿狀病毒感染昆蟲細(xì)胞或昆蟲宿主，培養(yǎng)被感染的昆蟲細(xì)胞或昆蟲宿 主表達(dá)相應(yīng)的抗原，純化，即得。
[0019] 本發(fā)明還公開了一種雞傳染性法氏囊病核酸疫苗的制備方法，包括以下步驟：
[0020] (1)分別將雞傳染性法氏囊病病毒原始VP2/4/3多聚蛋白基因、原始VP2基因、優(yōu) 化后的雞傳染性法氏囊病病毒VP2/4/3多聚蛋白基因或優(yōu)化后的雞傳染性法氏囊病病毒 VP2基因克隆到哺乳動物啟動子控制的桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體中，構(gòu)建得到重組轉(zhuǎn)移載體；
[0021] (2)將重組轉(zhuǎn)移載體與桿狀病毒DNA共轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞，獲得重組桿狀病毒；
[0022] (3)將重組桿狀病毒感染昆蟲細(xì)胞或昆蟲宿主，在昆蟲宿主或細(xì)胞中呈遞外源基 因，制備得到核酸疫苗。
[0023] 本發(fā)明所述哺乳動物啟動子選自CAG啟動子、PEC啟動子、CMV啟動子、人巨細(xì)胞病 毒早期啟動子、人延伸因子1-亞基啟動子、Rous肉瘤長末端重復(fù)序列、人leukosialin基 因啟動子、鼠3-磷酸甘油激酶1基因啟動子、人泛素蛋白C基因啟動子、雞|3 -肌動蛋白啟 動子和CMV增強子序列構(gòu)成的雜合啟動子或鼠乳房瘤病毒啟動子；優(yōu)選為CAG啟動子。
[0024] 本發(fā)明所述雞傳染性法氏囊病病毒原始VP2/4/3多聚蛋白基因的核苷酸序列為 SEQ ID NO. 1所示；所述原始VP2基因的核苷酸序列為SEQ ID NO. 2所示；
[0025] 所述桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體選自 AcRP23_lacZ、AcRP6_SC、AcUWl-lacZ、BacPAK6、Bac to Pac、Bacmid、BlucBacII(pETL)、p2Bac、p2Blue、p89B310、pAc360、pAc373、pAcAB3、pAcAB 4、PAcAS3、pAcC129、pAcC4、DZI、pAcGP67、pAcIEl、pAcJPl、pAcMLF2、pAcMLF 7、pAcMLF 8、 pAcMPl、pAcMP2、pAcRP23、pAcRP 25、pAcRW4、pAcsMAG、pAcUWl、pAcUW21、pAcUW2A、pAcUW2B、 pAcUW3、pAcUW31、pAcUW41、pAcUW42、pAcUW43、pAcUW51、pAcVC2、pAcVC 3、pAcYMl、pAcJcC5、 pBacl、pBac2、pBlueBacIII、pBlueBacHis、pEV55、mXIV、pIEINeo、pJVETL、pJVNhel、pJVP10、 pJVrsMAG、pMBac、pP10、pPAKl、pPBac、pSHONEX 1. 1、pSYN XIV VI+、pSYNVI+wp、pSYNXIV VI-、pVL1391、pVL 1392、pVL 1393、pVL941、pVL 945、pVL 985、pVTBac、pBM030 或pUAC-5; 優(yōu)選 PVL1393 ;
[0026] 所述桿狀病毒選自 BmNPV、AcMNPV、ApNPV、HaNPV、HzNPV、LdMNPV、MbMNPV、OpMNPV、 S1MNPV、SeMNPV、SpltNPV或家蠶桿狀病毒親本株BmBacmid ;優(yōu)選為家蠶桿狀病毒親本株 BmBacmid ；
[0027] 所述昆蟲宿主選自家蠶（Bombyx mori)、野蠶（Bombyx mandarina)、蓖麻蠶 (Philosamia cynthia ricim)、棒香（Dictyoploca japanica)、得香（Philosamia cynthia pryeri)、柞香（Antheraea pernyi)、曰本柞香（Antheraea yamamai)、野天香（Antheraea pol