yphymus)、苜蓿尺蠖（Atographa califorica)、茶尺蠖（Ectropis obliqua)、甘蘭夜 蛾（Mamestra brassicae)、斜紋夜蛾（Spodoptera littoralis)、秋粘蟲（Spodoptera frugiperda)、粉紋夜蛾（Trichoplusia ni)、行軍蟲（Thaumetopoea wilkinsoni)、棉鈴蟲 (Heliothis armigera)、美國棉鈴蟲（Heliothis zea)、煙青蟲（Heliothis assulta)、煙草 夜蛾（Heliothis virescens)、東方粘蟲（Pseudaletia separata)或舞毒蛾（Lymantria dispar);優(yōu)選為家香（Bombyx mori)；
[0028] 所述感染是指重組桿狀病毒通過吞食或透過表皮來感染1-5齡的昆蟲幼蟲或蛹 體；優(yōu)選為，將重組家蠶桿狀病毒感染家蠶細(xì)胞或穿刺接種1-5齡的家蠶幼蟲或蛹，在感染 3-6天后收集含各種雞傳染性法氏囊病毒抗原的家蠶幼蟲或蛹的體液或組織勻漿；其中， 所述的蛹最優(yōu)為1-2天的早期嫩蛹。
[0029] 本發(fā)明所構(gòu)建的重組轉(zhuǎn)移載體包括：含有雞傳染性法氏囊病毒VP2/4/3多聚蛋 白基因原始序列的載體PVL1393-IBDV-VP2/4/3 ;含有雞傳染性法氏囊病毒VP2蛋白基因 原始序列的載體PVL1393-IBDV-VP2 ;含有雞傳染性法氏囊病毒VP2/4/3多聚蛋白基因密 碼子優(yōu)化后序列的載體PVL1393-IBDV-VP2/4/3-0 ;含有優(yōu)化后VP2/4/3基因序列的載體 PVLCAG1393-IBDV-VP2/4/3-0 ;含有優(yōu)化后 VP2 基因序列的載體 pVLCAG1393-IBDV-VP2-0。
[0030] 本發(fā)明所獲得的重組桿狀病毒包括：重組家蠶核型多角體病 毒 rBmBacmid(Pph-IBDV-VP2/4/3)、rBmBacmid(Pph-IBDV-VP2/4/3-0)、 rBmBacmid(P PH-IBDV-VP2)、rBmBacmid(PPH-IBDV-VP2-0)、 rBmBacmid(CAG-IBDV-VP2/4/3-0)、rBmBacmid(CAG-IBDV-VP2-0)〇
[0031] 本發(fā)明方法所制備的雞傳染性法氏囊病病毒抗原能夠用于制備預(yù)防或治療雞傳 染性法氏囊病的藥物或試劑，為動(dòng)物提供有效免疫保護(hù)。
[0032] 本發(fā)明將雞傳染性法氏囊病病毒VP2/4/3多聚蛋白原始序列（SEQ ID NO. 1所 示）、VP2蛋白原始序列（SEQ ID NO. 2所示）分別在家蠶生物反應(yīng)器中表達(dá)，ELISA檢測(cè) 結(jié)果表明IBDV-VP2/4/3基因、IBDV-VP2基因在家蠶中表達(dá)量高，在1600倍稀釋度下抗原 與抗體的仍然呈現(xiàn)陽性反應(yīng)。Western blotting結(jié)果表明，在重組病毒感染后蠶血淋巴樣 品的上清液中可檢測(cè)到48kDa大小的特異性條帶。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，IBDV-VP2/4/3或 IBDV-VP2樣品組的中和抗體效價(jià)為1 :810以上，保護(hù)率為80%。
[0033] 本發(fā)明將雞傳染性法氏囊病毒優(yōu)化后的IBDV-VP2/4/3-0序列（SEQ ID NO. 3所 示）或優(yōu)化后的IBDV-VP2-0序列（SEQ ID NO. 4所示）在家蠶生物反應(yīng)器中表達(dá)，動(dòng)物實(shí) 驗(yàn)結(jié)果表明，1807-￥?2/4/3-0樣品組的中和抗體效價(jià)達(dá)到1:2430以上，保護(hù)率為90%以 上。
[0034] 本發(fā)明所制備的雞傳染性法氏囊病核酸疫苗經(jīng)注射或者口服免疫動(dòng)物能夠達(dá)到 免疫保護(hù)的效果，能夠應(yīng)用于制備預(yù)防或治療雞傳染性法氏囊病的藥物或試劑。
[0035] 本發(fā)明將雞傳染性法氏囊病病毒多聚蛋白優(yōu)化后的序列IBDV-VP2/4/3-0(SEQ ID NO. 3所示）或優(yōu)化后的IBDV-VP2-0序列（SEQ ID NO. 4所示）在家蠶生物反應(yīng)器中進(jìn)行擴(kuò) 增，制備核酸疫苗。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，IBDV-VP2/4/3-0或IBDV-VP2/4/3-0核酸樣品組的 中和抗體效價(jià)不少于1 :7290,保護(hù)率為100% ;對(duì)照組發(fā)病率達(dá)到80%以上。
[0036] 本發(fā)明技術(shù)方案與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下有益效果：
[0037] 本發(fā)明成功實(shí)現(xiàn)了利用家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)在昆蟲體內(nèi)安全、高效的表達(dá)傳染 性法氏囊病病毒VP2蛋白和VP2/4/3多聚蛋白。通過密碼子優(yōu)化使VP2/4/3多聚蛋白和VP2 蛋白的表達(dá)量明顯提高；尤其VP2/4/3多聚蛋白的表達(dá)產(chǎn)量比優(yōu)化前提高4倍，中和抗體效 價(jià)提高3倍以上。本發(fā)明還將優(yōu)化后的VP2/4/3多聚蛋白基因或VP2蛋白基因在家蠶生物 反應(yīng)器中進(jìn)行呈遞，制備得到核酸疫苗，所制備的核酸疫苗可使免疫動(dòng)物的中和抗體提高 到1 :7290,攻毒保護(hù)率達(dá)到90%以上。本發(fā)明采用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)在家蠶生物反應(yīng)器中 表達(dá)雞傳染性法氏囊病病毒抗原制備基因工程蛋白疫苗或制備核酸疫苗，具有經(jīng)濟(jì)、安全、 高效、安全性好，免疫效果好等優(yōu)點(diǎn)。
[0038] 本發(fā)明所涉及到的術(shù)語宙義
[0039] 除非另外定義，否則本文所用的所有技術(shù)及科學(xué)術(shù)語都具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的 普通技術(shù)人員通常所了解相同的含義。
[0040] 術(shù)語"多核苷酸"或"核苷酸"意指單股或雙股形式的脫氧核糖核苷酸、脫氧核糖 核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否則所述術(shù)語涵蓋含有天然核苷 酸的已知類似物的核酸，所述類似物具有類似于參考核酸的結(jié)合特性并以類似于天然產(chǎn)生 的核苷酸的方式進(jìn)行代謝。除非另外特定限制，否則所述術(shù)語也意指寡核苷酸類似物，其包 括PNA(肽核酸）、在反義技術(shù)中所用的DNA類似物（硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等）。除非 另外指定，否則特定核酸序列也隱含地涵蓋其保守修飾的變異體（包括（但不限于）簡(jiǎn)并 密碼子取代）和互補(bǔ)序列以及明確指定的序列。特定而言，可通過產(chǎn)生其中一個(gè)或一個(gè)以 上所選（或所有）密碼子的第3位經(jīng)混合堿基和/或脫氧肌苷殘基取代的序列來實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn) 并密碼子取代（Batzer 等人，Nucleic Acid Res. 19:5081(1991) ;Ohtsuka 等人，J.Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985);和 Cassol 等人，（1992) ;Rossolini 等人，Mol Cell. Probes 8:91-98(1994))〇
[0041] 術(shù)語"宿主細(xì)胞"或"重組宿主細(xì)胞"意指包含本發(fā)明多核苷酸的細(xì)胞，而不管使 用何種方法進(jìn)行插入以產(chǎn)生重組宿主細(xì)胞。
[0042] 術(shù)語"轉(zhuǎn)染"指真核細(xì)胞由于外源DNA摻入而獲得新的遺傳標(biāo)志的過程。
[0043] 可互換使用的術(shù)語"疫苗"或"疫苗組合物"指這樣的藥物組合物，其包括在動(dòng)物 中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的至少一種免疫原性組合物。疫苗或疫苗組合物可以保護(hù)動(dòng)物免受由于感 染的疾病或可能的死亡，并且可以包括或不包括增強(qiáng)活性組分的免疫活性的一種或多種另 外組分。疫苗或疫苗組合物可以另外包括對(duì)于疫苗或疫苗組合物典型的進(jìn)一步組分，包括 例如佐劑或免疫調(diào)節(jié)劑。疫苗的免疫活性組分可以包括以其原始形式的完全活生物體或在 經(jīng)修飾的活疫苗中作為經(jīng)減毒的生物體，或在經(jīng)殺死或滅活的疫苗中通過合適方法滅活的 生物體，或包括病毒的一種或多種免疫原性組分的亞單位疫苗，或通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已 知的方法制備的遺傳改造、突變或克隆的疫苗。疫苗或疫苗組合物可以包括一種或同時(shí)超 過一種上述組分。
【附圖說明】
[0044] 圖1為轉(zhuǎn)移載體PVL1393示意圖；
[0045] 圖2為真核表達(dá)優(yōu)化后IBDV多聚蛋白和IBDV VP2蛋白基因產(chǎn)物的Western-blot 分析；其中，M :蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1 :表達(dá)IBDV-VP2/4/3-0蠶血淋巴樣品；2 :表達(dá) IBDV-VP2-0蠶血淋巴樣品；3 :蠶血淋巴陰性對(duì)照；
[0046] 圖3為IBDV類病毒粒子電鏡圖；其中，A :IBDV VLPs電鏡圖；B、C、D :金標(biāo)二抗標(biāo) 記的IBDV VLPs電鏡圖；標(biāo)尺：200nm ;
[0047] 圖4為轉(zhuǎn)移載體pVLCAG-1393示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0048] 下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而 更為清楚。但是應(yīng)理解所述實(shí)施例僅是范例性的，不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng) 域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié) 和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改或替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0049] 1、實(shí)驗(yàn)材料
[0050](1)菌株、病毒株與載體：原核表達(dá)載體pET-28a(+)、大腸桿菌T0P10菌株、原核 表達(dá)菌株BL21 (DE3)、家蠶細(xì)胞BmN、家蠶核型多角體病毒親本株BmBacmid(專利申請(qǐng)?zhí)枮椋?201110142492. 4,申請(qǐng)公布號(hào)CN 102286534A)、家蠶品種JY1均為中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技 術(shù)研宄所分子微生物實(shí)驗(yàn)室保存；轉(zhuǎn)移載體PVL1393購自于Invitrogen公司；克隆載體 PMD18-T購自寶生物工程（大連）有限公司；
[0051] (2)IBDV VP2/4/3多聚蛋白和VP2蛋白基因序列：雞傳染性法氏囊病病毒VP2/4/3 多聚蛋白基因的原始序列是從發(fā)病動(dòng)物病灶組織中提取并克隆到PMD18-T載體上得到；原 始的VP2基因序列是以原始VP2/4/3基因序列為模板擴(kuò)增得到的；
[0052] (3)酶與試劑：限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶及所對(duì)應(yīng)的緩沖液均購自Promega 公司；LA Taq聚合酶及緩沖液購自TaKaRa公司；各種規(guī)格的DNA和蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)為 TranGen Biotech公司產(chǎn)品；2K Plus II DNA Marker購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；辣 根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗購自MBL公司；DEPC、M-MLV-Rtase (逆轉(zhuǎn)錄酶）購 自Promega公司；
[0053] (4)生化試劑：Tris、Ampicillin、Kanamycin、IPTG、SDS、尿素、咪挫、 TritonX-100