壤、保護(hù)作物免受阿特拉津或其他三嗪類化合物藥害的應(yīng)用方法。方法包括生物菌 劑浸種作物種子，并將接種種子播種到污染土壤中。種子萌發(fā)后，A. ureafaciens liuloul 競爭性定殖到幼苗根系并形成優(yōu)勢(shì)菌群以降解土壤中阿特拉津、解毒土壤及保護(hù)作物避免 阿特拉津藥害。浸種種子在播種前能長時(shí)間貯存，且liuloul在種子表面能保持使用的有 效量。該Arthrobacter ureafaciens liulou 1以最低濃度為每粒種子102CFU接種種子 或接種濃度更高，其能在作物根際有效定殖，并形成優(yōu)勢(shì)菌群。
[0014] 該Arthrobacter ureafaciens liulou 1以最低濃度為每粒種子102CFU接種種 子或接種濃度更高，其能明顯促進(jìn)作物幼苗根長的生長。A. ureafaciens liuloul在接種種 子表面具有有效的濃度，為每粒種子1〇2到10 8CFU，貯存時(shí)，最合適的有效起始濃度是每粒 種子104到108CFU之間。
[0015] A. ureafaciens liuloul應(yīng)用方法成本低廉，大規(guī)模修復(fù)阿特拉津及其他三嘆類 化合物污染土壤時(shí)，不干擾植物生長。且能降低地下水及地表水庫中阿特拉津的污染，具有 較高的社會(huì)和生態(tài)效益。
【附圖說明】：
[0016]圖1所示為以玉米根際土為樣本，SM固體培養(yǎng)基直接分離阿特拉津降解菌株 (28°C培養(yǎng)3天）；
[0017] 圖2所示為阿特拉津降解菌株liulou 1在添加0. 1克/升酵母粉的SM固體培養(yǎng) 基上的形態(tài)；
[0018] 圖3所示為基于16S序列構(gòu)建鄰聚法親緣關(guān)系樹型，顯示阿特拉津降解菌屬于節(jié) 桿菌屬；GenBank序列號(hào)顯示在括號(hào)里。步長值（節(jié)點(diǎn)后的數(shù)字表示100自展后的數(shù)值）大 于50 %標(biāo)注在分支點(diǎn)；標(biāo)尺所示長度為0. 005核苷酸置換率；進(jìn)化分析采用MEGA5 ;
[0019] 圖4所示為B0X-PCR模型，其中，L孔道為liulou 1菌株;Au孔道為產(chǎn)脲節(jié)桿菌 CGMCC 1. 1897 模式菌株；An 孔道為 A. nitroguajacolicus CGMCC 1. 7300 菌株；As 孔道 為八.8111作11"〇四118〇6110： 1.3977;]\1為0嫩1&11?^012,000〇^1?1四生物有限公司（大 連））；
[0020] 圖5所示為ERIC-PCR模型，其中L孔道為liulou 1菌株；Au孔道為產(chǎn)脲節(jié)桿菌 CGMCC 1. 1897 模式菌株；Ml 和 M2 分別為 100bp DNA Ladder 和 DL2, 000DNA Maker (Takara 生物有限公司（大連））；
[0021] 圖6所示為多重PCR檢測產(chǎn)脲節(jié)桿菌liulou 1阿特拉津降解基因；孔道：R1為 含有 atzA，atzB 和 atzC 的 Pseudomonas sp. D3-11 ;R2 為含有 atzB，atzC 和 trzN 基因的 Arthrobacter sp. SD41 ;L 為產(chǎn)脈節(jié)桿菌 liulou 1 ;M 為 DL 2, 000DNA Marker ;
[0022] 圖7所示為產(chǎn)脲節(jié)桿菌liulou 1在不同瓊脂濃度界面運(yùn)動(dòng)能力；
[0023] 圖8所示為產(chǎn)脲節(jié)桿菌liulou 1在不同瓊脂濃度界面運(yùn)動(dòng)速度和距離；
[0024] 圖9所示為定殖試驗(yàn)結(jié)束后，小麥根際產(chǎn)脲節(jié)桿菌liulou 1的檢測；
[0025] 圖10所示為小麥種子接種產(chǎn)脲節(jié)桿菌liulou 1，其幼苗不受阿特拉津藥害；
[0026] 圖11所示為苜蓿種子接種產(chǎn)脲節(jié)桿菌liulou 1，其幼苗不受阿特拉津藥害；
[0027] 圖12所示為產(chǎn)脲節(jié)桿菌liulou 1在SMP平板上劃線培養(yǎng)后產(chǎn)生的溶磷圈。
【具體實(shí)施方式】：
[0028] 為了更好地理解本發(fā)明，下面用具體實(shí)例來詳細(xì)說明本發(fā)明的技術(shù)方案，但是本 發(fā)明并不局限于此。
[0029] 實(shí)施例1菌株liulou 1的分離
[0030] 菌株liulou 1由SM固體培養(yǎng)基直接分離獲得，其中阿特拉津作為唯一的氮源， Tween 80作為分散劑。表面活性劑使疏水性阿特拉津在SM培養(yǎng)基中的可利用性得到改善， 能利用平板從不同來源的土壤包括工業(yè)土壤和農(nóng)業(yè)土壤，進(jìn)行阿特拉津降解菌株的選擇性 篩選。富集階段的省略消除了富集偏差，使在環(huán)境中占主導(dǎo)地位的阿特拉津降解菌得到分 離。
[0031] 菌株liulou 1從長期使用阿特拉津的玉米根際分離獲得，取樣地址為山東省菏 澤市定陶縣濱河辦事處劉樓村玉米田。
[0032] 取生長期的玉米根及根際周圍15X10X 10cm的土壤作為樣品。取樣第二天，將玉 米根系小心的取出，去除松散的土壤，根表面的土刮下來懸浮于緩沖液中（SM培養(yǎng)基的鹽 溶液），10倍梯度稀釋后涂布于SM固體平板上。28°C培養(yǎng)三天后，在平板上能產(chǎn)生降解圈 的菌落即為阿特拉津降解菌株（請(qǐng)見說明書附圖圖1)。高稀釋梯度分離到的降解菌株再 重復(fù)劃線到SM固體培養(yǎng)基（添加0. 1克/升的酵母粉）上進(jìn)行純化。根據(jù)一系列的試驗(yàn)， 我們分離到了阿特拉津降解菌株liulou 1 (說明書附圖圖2)，該菌株含有阿特拉津降解基 因，具有降解阿特拉津活性，能在半固體瓊脂上擴(kuò)展，接種作物種子后能在作物根際有效定 殖，能耐干旱并可在干種子上長時(shí)間存活，與植物聯(lián)合能降解土壤中的阿特拉津，能促進(jìn)根 長生長，具解磷作用。
[0033] 實(shí)施例2產(chǎn)脲節(jié)桿菌liulou1系統(tǒng)發(fā)育鑒定
[0034] 方法
[0035] 16S rRNA 基因擴(kuò)增弓丨物對(duì) 63KWf (5, CAKGCCTWACACATGCAAGTC 3'）和 1287r (5, GGGCGGWGTGTACAAGGC 3,）。PCR 為 50 y L 體系，5 y L 10 X Ex Taq Buffer (Takara 生物有限公司（大連）），2.0mM MgCl2, 250 yM dNTP，0.5yM 引物，0.5U TaKaRa Ex Taq 聚 合酶和1. 25 y L細(xì)菌裂解液作為模板。PCR的擴(kuò)增體系是，預(yù)變性95°C，3分鐘；94°C變性1 分鐘，55°C退火1分鐘，72 °C延伸2分鐘，30個(gè)循環(huán)；最后72 °C延伸5分鐘。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 用0. 5XTBE緩沖液進(jìn)行電泳分析。切膠回收1. 3kb目標(biāo)片段，利用TaKaRa MiniBEST瓊脂 糖DNA切膠回收試劑盒4. 0進(jìn)行回收?；厥掌巫鳛槟０逵?3KWf和1287r引物擴(kuò)增后進(jìn) 行測序。測序分析是利用3730x1 DNA分析儀進(jìn)行（AB公司，美國）。測序后的DNA序列通 過人工檢測進(jìn)行校對(duì)分析。
[0036] BLASTn是通過與GenBank中16S核糖體RNA序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)。進(jìn)化分析是利 用MEGA5軟件包進(jìn)行。liuloul的16S序列與模式菌株相似性達(dá)到98%以上。多序列比對(duì) 通過CLUSTALW進(jìn)行。系統(tǒng)發(fā)育樹分析是利用去除丟失的數(shù)據(jù)和間隙的序列基于鄰接法構(gòu) 建的。
[0037] 結(jié)果
[0038] liulou 1的部分16S核苷酸序列（1255bp)見附圖
[0039] 經(jīng)BLAST比對(duì)，菌株liulou 1屬于節(jié)桿菌屬（放線菌門、放線菌綱、放線菌亞 綱、放線菌目、微球菌亞目、微球菌科、節(jié)桿菌屬），與產(chǎn)脲節(jié)桿菌模式菌株NC的序列相 似性達(dá)到99.6%。進(jìn)化樹分析暗示著在步長值為100的條件下，liulou 1與產(chǎn)脲節(jié)桿 菌（A.ureafaciens)模式菌株NC近緣（說明書附圖圖3)。liulou 1和模式菌株產(chǎn)脲 節(jié)桿菌（A. ureafaciens)NC之間的核苷酸差異比模式菌株A. phenantrenivorans Sphe3 和A. chlorophenolicus A6之間的核苷酸差異小，這表明菌株liulou 1與產(chǎn)脲節(jié)桿菌 (A. ureafaciens)近緣。
[0040] 實(shí)施例3重復(fù)序列PCROtep-PCR)方法對(duì)liulou 1菌株進(jìn)行分類和鑒定
[0041] 方法
[0042] liulou 1 菌株鑒定是通過以 B0XA1R(5'CTACGGCAAGGCGACGCTGACG 3'）和 ERIC2 (5' AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG 3'）引物為基礎(chǔ)的重復(fù)序列 PCR(Itep-PCR)進(jìn)行 的。PCR反應(yīng)體系為20yL，2yL lOXEx Taq Buffer，（Takara生物有限公司（大連））， 2.0mM MgCl2,250 yM dNTP，0.5yM 引物，0.5U TaKaRa Ex Taq 聚合酶和 0.5yL 模板。 R印-PCR的擴(kuò)增體系是，預(yù)變性95 °C，3分鐘；94 °C變性1分鐘，40 °C (ERIC-PCR)或者 55°C (B0X-PCR)退火1分鐘，68°C延伸8分鐘，4個(gè)循環(huán)；94°C變性1分鐘，52°C (ERIC-PCR) 或者65 °C (B0X-PCR)退火1分鐘，72 °C延伸2分鐘，30個(gè)循環(huán)；最后72 °C延伸5分鐘。PCR擴(kuò) 增產(chǎn)物用〇.5\了8￡緩沖液，2%瓊脂糖（66鮮16￥，〇1111&)，膠內(nèi)添加50^1716〇1沢16￥(北 京鼎國昌盛科技有限公司）核酸染料進(jìn)行電泳分析。
[0043]對(duì)照菌株為 A.ureafaciens(CGMCC 1. 1897 ( = NC))，Arthrobacter nitroguajacolicus(CGMCC 1.7300)，和 Arthrobacter sulfonivorans(CGMCC 1.3977)。
[0044] 結(jié)果
[0045] B0X-PCR分型顯示liulou 1的標(biāo)記模式與產(chǎn)脲節(jié)桿菌CGMCC1. 1897具有相似性 (說明書附圖圖4)，暗示著它們的BOX分型屬于一類。鑒于R印-PCR是種內(nèi)基于遺傳學(xué)差 異的菌株鑒定方法，菌株liulou 1應(yīng)該歸類于產(chǎn)脲節(jié)桿菌（A.ureafaciens)。
[0046] ERIC-PCR分型結(jié)果顯示1 iulou 1的條帶模型與模式菌株產(chǎn)脲節(jié)桿菌CGMCC 1. 1897并沒有相似性（說明書附圖圖5)，表明它們隸屬于不同的ERIC類型。ERIC分型可 以用作liulou 1的個(gè)體鑒定以及與liulou 1具有相同特征的菌株鑒定。
[0047] 實(shí)施例4產(chǎn)脲節(jié)桿菌liulou 1中阿特拉津降解基因的鑒定
[0048] 方法
[0049] 產(chǎn)脲節(jié)桿菌liulou 1中atzA，atzB，atzC和trzN基因的檢測是分別利用引物對(duì) atzA250f/atzA65