磷酸三鈣(Ca3(PO4)2)在使用前需過100目(0.15mm)篩，然后用去離子水清洗3_5遍，以防在滅菌過程中結(jié)塊而影響培養(yǎng)基中養(yǎng)分有效性。
[0031](3)解磷細(xì)菌的提取、培養(yǎng)與篩選:將上述振蕩培養(yǎng)45_50h后的培養(yǎng)液按10—1，Kr2至?ο ,的濃度梯度進行稀釋，每間隔一個濃度梯度，即按?ο Λ ιοΛ ?ο' ?ο,梯度分別取100 μ L稀釋液，用玻璃涂布棒均勻涂在無機磷固體培養(yǎng)基平板上，并放置于29-33?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在培養(yǎng)到5-7d后，即可用肉眼觀察到平板中菌落的生長情況及溶磷圈的大小，即為所提取的無機解磷細(xì)菌。用接種針挑取帶有溶磷圈的菌落，再按照上述方法進行復(fù)篩、劃線分離、純化。將純化后的菌液放入經(jīng)滅菌處理后并裝有20 %濃度的甘油液體保菌管中(要求菌液與甘油液體比例為1:1)，并置于_80°C超低溫冰箱中密閉保存。無機磷固體培養(yǎng)基是在無機磷液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入15-18g瓊脂后的配置而成，要求其pH值保持在6.8-7.4之間。
[0032]實施例3
[0033]一種提取刨花楠林地土壤無機解磷細(xì)菌的方法，采用的技術(shù)方案如下:
[0034]用移液槍吸取上述實施例的根際土壤懸濁液配置方法配制的土壤懸濁液中的上清液2ml置于50ml的無機磷液體培養(yǎng)基，混勻后放入溫度保持在29°C、轉(zhuǎn)速為160r/min的恒溫?fù)u床中振蕩培養(yǎng)48h。將振蕩培養(yǎng)48h后的培養(yǎng)液按10—1，10_2至10 _1(1的濃度梯度進行稀釋，每間隔一個濃度梯度，即按10_4，10_6，10_8，10,梯度分別取100 μ L稀釋液，均勻涂在無機磷固體培養(yǎng)基平板上，并放置于29°C的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在培養(yǎng)到7d后，可用肉眼觀察到平板中菌落的生長情況及溶磷圈的大小，即為所提取的無機解磷細(xì)菌。培養(yǎng)基的PH值為7.0。
[0035]實施例4
[0036]一種提取刨花楠林地土壤無機解磷細(xì)菌的方法，采用的技術(shù)方案如下:
[0037]用移液槍吸取上述實施例的根際土壤懸濁液配置方法配制的土壤懸濁液中的上清液2ml置于50ml的無機磷液體培養(yǎng)基，混勻后放入溫度保持在32°C、轉(zhuǎn)速為180r/min的恒溫?fù)u床中振蕩培養(yǎng)45h。將振蕩培養(yǎng)45h后的培養(yǎng)液按ΙΟ—1，10_2至10 _1(1的濃度梯度進行稀釋，每間隔一個濃度梯度，即按10_4，10_6，10_8，10,梯度分別取100 μ L稀釋液，均勻涂在無機磷固體培養(yǎng)基平板上，并放置于32°C的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在培養(yǎng)到5d后，可用肉眼觀察到平板中菌落的生長情況及溶磷圈的大小，即為所提取的無機解磷細(xì)菌。培養(yǎng)基的PH值為7.2。
[0038]以上所述僅為本發(fā)明的實施例，并非因此限制本發(fā)明的專利范圍，凡是利用本發(fā)明說明書內(nèi)容所作的等同變換，或直接或間接運用在相關(guān)的技術(shù)領(lǐng)域，均同理包括在本發(fā)明的專利保護范圍內(nèi)。
【主權(quán)項】
1.一種提取刨花楠林地土壤無機解磷細(xì)菌的方法，其特征在于，包括如下步驟: 將刨花楠根際土壤懸濁液中的上清液以1:25的體積比加入到無機磷液體培養(yǎng)基，混勻后放入溫度保持在29-33°C、轉(zhuǎn)速為140-180r/min的恒溫?fù)u床中振蕩培養(yǎng)45_50h，得培養(yǎng)液； 將所述培養(yǎng)液按1-1S 10 -1°每10倍一個濃度梯度進行梯度稀釋，取10 Λ ιοΛ ιο_8，10_1(1的濃度的培養(yǎng)液100 μ L，均勻涂在無機磷固體培養(yǎng)基平板上，并放置于29-33?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在培養(yǎng)到5-7d后，即可得無機解磷細(xì)菌菌落； 所述無機磷液體培養(yǎng)基包括如下重量份的原料混合而成:葡萄糖10份、磷酸三鈣5份、氯化鎂5份、七水硫酸鎂0.25份、與氯化鉀0.2份和蒸餾水1000份； 所述無機磷固體培養(yǎng)基是在所述無機磷液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入15-18重量份的瓊脂后的配置而成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取刨花楠林地土壤無機解磷細(xì)菌的方法，其特征在于，所述無機磷液體培養(yǎng)基通過滴入3-6mol/L的鹽酸使其pH值保持在6.8-7.4之間。
3.根據(jù)權(quán)利要求1至2任一項所述的提取刨花楠林地土壤無機解磷細(xì)菌的方法，其特征在于，所述刨花楠根際土壤懸濁液的制備方法如下:稱取從刨花楠林地0-5cm的土層中采集并放入4°C冰箱保存的根際土壤鮮樣0.5g，所述根際土壤鮮樣離刨花楠根際0-4mm，將根際土壤鮮樣倒入裝有4ml蒸飽水的無菌離心管中，漩禍振蕩3min，靜置30min，得刨花楠根際土壤懸濁液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取刨花楠林地土壤無機解磷細(xì)菌的方法，其特征在于，具體為: 將刨花楠根際土壤懸濁液中的上清液2ml置于50ml的無機磷液體培養(yǎng)基，混勻后放入溫度保持在29-33°C、轉(zhuǎn)速為140-180r/min的恒溫?fù)u床中振蕩培養(yǎng)48h ； 將所述培養(yǎng)液按1-1S 10 -1°每10倍一個濃度梯度進行梯度稀釋，取10 Λ ιοΛ ιο_8，10_1(1的濃度的培養(yǎng)液100 μ L，均勻涂在無機磷固體培養(yǎng)基平板上，并放置于29-33?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在培養(yǎng)到5-7d后，即可得無機解磷細(xì)菌菌落； 所述無機磷液體培養(yǎng)基包括如下重量份的原料混合而成:葡萄糖10g、磷酸三鈣5g、氯化鎂5g、七水硫酸鎂0.25g、與氯化鉀0.2g和蒸餾水100ml ;所述無機磷液體培養(yǎng)基通過滴入3-6mol/L的鹽酸使其pH值保持在7.0 ； 所述無機磷固體培養(yǎng)基是在所述無機磷液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入15_18g的瓊脂后的配置而成。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取刨花楠林地土壤無機解磷細(xì)菌的方法，其特征在于，還包括:將所述無機解磷細(xì)菌菌落用接種針挑取帶有溶磷圈的菌落，再進行劃線分離、純化，將純化后的菌液放入經(jīng)滅菌處理后并裝有20%濃度的甘油液體保菌管中，并置于-80°C超低溫冰箱中密閉保存。
【專利摘要】本技術(shù)發(fā)明屬于植物栽培技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種提取刨花楠林地土壤無機解磷細(xì)菌的方法，包括如下步驟：將刨花楠根際土壤懸濁液中的上清液以1:25的體積比加入到無機磷液體培養(yǎng)基，混勻后放入恒溫?fù)u床中振蕩培養(yǎng)45-50h，得培養(yǎng)液；將進行梯度稀釋的培養(yǎng)液100μL均勻涂在無機磷固體培養(yǎng)基平板上，并放置于29-33℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在培養(yǎng)到5-7d后，即可得無機解磷細(xì)菌菌落。本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明提供的提取刨花楠林地土壤無機解磷細(xì)菌方法，可使培養(yǎng)基在滅菌的過程中不結(jié)塊、不發(fā)黃，培養(yǎng)液中的有效養(yǎng)分能夠被有效、充分利用，并能顯著提高獲取的解磷細(xì)菌的種類、數(shù)量與密度，便于進一步優(yōu)選與純化。
【IPC分類】C12N1-20
【公開號】CN104762240
【申請?zhí)枴緾N201510203310
【發(fā)明人】鐘全林, 張蕾蕾, 何寧, 鄭躍芳, 程棟梁, 徐朝斌
【申請人】福建師范大學(xué)
【公開日】2015年7月8日
【申請日】2015年4月27日