雜交瘤細胞bpa-4c7及其產(chǎn)生的雙酚a單克隆抗體的制作方法
【專利說明】雜交瘤細胞BPA-4C7及其產(chǎn)生的雙酚A單克隆抗體
[0001]
技術(shù)領(lǐng)域
[0002]本發(fā)明涉及雜交瘤細胞株BPA-4C7及其產(chǎn)生的雙酚A單克隆抗體。
【背景技術(shù)】
[0003]雙酚A (Bisphenol A，BPA)是一種具有雌激素活性的物質(zhì)，會擾亂人體內(nèi)的代謝過程。雙酚A能引起生殖器官異常、使雄性雌性化，還可能誘發(fā)某些癌癥。從2011年3月I日起已被歐盟禁止在生產(chǎn)嬰兒奶瓶的塑料中使用，中國從2011年6月I日起禁止生產(chǎn)含雙酚A的嬰幼兒奶瓶。雙酚A是重要的化工原料，是制造聚碳酸酯、環(huán)氧樹脂、聚樹脂等的前體物質(zhì)，廣泛用于食品包裝材料、容器內(nèi)壁涂料等日常生活中經(jīng)常接觸的材料，可通過包裝容器和塑料薄膜滲入食品或飲料進行體內(nèi)。即使很低的劑量BPA也能使動物產(chǎn)生雌性早熟、精子數(shù)下降、前列腺增長等。BPA還具有一定的胚胎毒性和致畸性，可明顯增加動物卵巢癌、前列腺癌、白血病等癌癥的發(fā)生。
[0004]目前，食品包裝材料及食品中雙酚A以痕量水平存在，因此其檢測技術(shù)主要采用精密儀器分析法進行。檢測方法主要采用液相色譜法、氣相色譜一質(zhì)譜法以及液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜法。這些方法測定的準確度較高，重復性較好，但需配備大型較昂貴的設(shè)備，費用高，對操作人員要求高。酶聯(lián)免疫法集合了抗原抗體反應(yīng)的高特異性與酶促反應(yīng)的高度敏感性。這種方法具有檢測范圍寬、靈敏度高、特異性好、成本低、對操作人員要求也低。但要研宄建立針對雙酚A (BPA)的任何一種免疫學檢測技術(shù)，都必須先獲得抗雙酚A (BPA)的抗體。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的問題是提供雜交瘤細胞株BPA-4C7及其產(chǎn)生的雙酚A (BPA)的單克隆抗體。
[0006]本發(fā)明提供了雜交瘤細株BPA-4C7，該細胞株已于2014年12月12日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是，中國，北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研宄所，保藏編號為CGMCC N0.10201分類命名為S/P20雜交瘤細胞。
[0007]抗雙酚A單克隆抗體由保藏編號為CGMCC N0.10201的雜交瘤細胞株BPA -4C7分泌產(chǎn)生。該BPA單克隆抗體可以識別雙酚A，對雙酚A的50%抑制濃度IC50為0.28 μ g/L。
[0008]抗雙酸A單克隆抗體在雙酸A測定中的應(yīng)用。
[0009]本發(fā)明提供的雜交瘤細胞株BPA-4C7單克隆抗體是采用三步法篩選獲得的，其具體步驟是:以BPA在4-溴丁酸乙酯作用下生成BPA羧酸酯，再水解生成BPA羧酸，在EDC和NHS存在的條件下和BSA偶聯(lián)生成BPA-BSA。用其免疫BLAB/c小鼠4次，最后一次加強免疫用2倍與前一次免疫劑量的BPA-BSA，免疫3天后進行細胞融合。采用ELISA分兩步法進行篩選融合細胞:第一步采用間接ELISA法篩選出僅能抗雙酚A而不抗載體蛋白BSA的陽性克??；第二步采用間接競爭ELISA法對第一步篩選出的陽性克隆培養(yǎng)液進行檢測，采用BPA作為競爭源，選擇吸光度值低、靈敏度較高的陽性克隆進行有限稀釋法繼續(xù)克隆，克隆10天后采用同樣的兩步篩選法進行抗體檢測，如此重復2次，最終篩選獲得的雜交瘤細胞BPA-4C7。
[0010]本發(fā)明提供的雙酚A單克隆抗體的制備方法，步驟如下:將獲得的雜交瘤細胞株BPA-4C7注射預先用弗氏不完全佐劑處理過的BALB/c小鼠，收集該小鼠的腹水，純化處理后獲得抗雙酚A的單克隆抗體。
[0011]上述純化方法的具體操作為:腹水于4°C，3000r/min離心5min以上，吸取上清，將上清與2倍體積的醋酸鹽緩沖液混合，邊攪拌邊緩慢加入正辛酸，每毫升腹水所需的正辛酸體積為33yL，室溫混合30min，4°C靜置2h以上，使其充分沉淀。然后4°C，12000r/min離心30min以上，棄沉淀，將得到的上清液用砂芯漏斗過濾后，加入1/10濾液體積的0.1mol/L ρΗ7.4的磷酸鹽緩沖液，用2 mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7.4，4°C預冷I小時，緩慢加入0.277g/mL硫酸銨至硫酸銨終濃度為45%，4°C靜置2h以上，然后40C 12000r/min離心30min，棄上清，將所得沉淀用原腹水體積1/10的0.01mol/L磷酸鹽緩沖液重懸，裝入透析袋，用0.01mol/L磷酸鹽緩沖液透析，將充分透析好的蛋白溶液加入等體積甘油，置-20°C冰箱中備用；
醋酸鹽緩沖液:0.29g醋酸鈉加入0.141mL醋酸，純水定容至10mL ；
0.1mol/L磷酸鹽緩沖液:0.8g氯化鈉，0.29g十二水磷酸氫二鈉，0.02g氯化鉀，0.02g磷酸二氫鉀，加水定容至100mL。
[0012]0.01mol/L磷酸鹽緩沖液:用純水將0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液稀釋10倍。
[0013]本發(fā)明的有益效果在于:
I本發(fā)明提供的雜交瘤細胞BPA-4C7可以用于制備高效價的抗雙酚A單克隆抗體，將雙酚A小鼠腹水抗體酶聯(lián)免疫吸附方法測定的效價達到3.12X106，即腹水稀釋至3.12X 16時溶液測定結(jié)果仍為陽性。
[0014]2本發(fā)明提供的雙酚A單克隆抗體靈敏度高、特異性好，對雙酚A的半抑制濃度IC50為0.28 μ g/L,與雙酚酸的交叉反應(yīng)率103%，與雙酚C的交叉反應(yīng)率9.9%，與己烯雌酚的交叉反應(yīng)率〈1%。
[0015]3本發(fā)明提供的抗雙酚A的單克隆抗體可用于測定雙酚A的含量。
【附圖說明】
[0016]圖1 BPA-4C7單克隆抗體對BPA的檢測標準曲線。
【具體實施方式】
[0017]實施例1:雜交瘤細胞株BPA-4C7的篩選
1.抗原的合成及動物的免疫
BPA通過活化得到BPA羧酸酯，水解得到BPA羧酸，再在EDC和NHS存在的條件下與載體蛋白發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)，得到相應(yīng)的人工抗原。
[0018]BPA羧酸的合成將1.14g BPA溶于30mL丙酮，加入276mg碳酸鉀。將143 μ L 4-溴丁酸乙酯溶于ImL丙酮，然后將該溶液滴加到沸騰的BPA溶液中，得到化合物Α。將18mg化合物A溶于2mL乙醇，然后將IM氫氧化鈉溶液(0.5ml)加入其中。反應(yīng)液在油浴中加熱回流I小時。壓蒸餾得到產(chǎn)物的鈉鹽。用水(2ml)將粗品溶解，用2M鹽酸調(diào)至pH=2，然后用乙酸乙酯萃取(2mLx4),乙酸乙酯相用無水硫酸鈉干燥，吹干得到BPA的羧酸(白色晶體12mg)。
[0019]人工抗原的合成
取將12mg干燥的BPAB溶于1.2ml的DMF中配制成10mg/ml溶液備用。將EDC(85mg)和NHS (27mg)溶于DMF (0.6ml)中，取配置好的BPAP溶液(0.6ml)滴加到EDC的溶液中，室溫震蕩24個小時得到活化的BPAP溶液。在3ml的棕色試劑瓶中加入0.282ml的硼酸-硼砂緩沖液(0.2M, pH=7.4)和0.718ml的BSA液(50mg/ml)，然后將活化好的BPAP溶液(0.4ml)滴加到BSA溶液中，室溫攪拌20個小時。反應(yīng)完成后，用2L PBS透析3次，每次一天。最后將透析袋中的液體收集，_20°C保存。
[0020]人工抗原的鑒定
通過紫外光譜掃描法及質(zhì)譜鑒定表明制備得到了雙酚A的完全抗原BPA-BSA。
[0021]購買6周齡雌性BALB/c小鼠6只，免疫自行合成的雙酚A的完全抗原BPA-BSA。第一次免疫將完全抗原BPA-BSA與等量弗氏完全佐劑混合乳化，然后小鼠頸背部皮下多點注射。第二次免疫于首免3周后進行，采用弗氏不完全佐劑與等體積完全抗原BPA-BSA乳化，免疫劑量與方法與首免相同。第三次免疫與第二次免疫間隔時間3周，免疫劑量和方法與第二次相同。第四次免疫于第三次免疫3周后進行，免疫方式及免疫劑量與第三次免疫相同，每次免疫劑量為每鼠30yg。前3次每次免疫后一周，眼周采血，分離血清，采用間接ELISA法監(jiān)測小鼠血清抗體效價。第4次免疫后3天，尾靜脈采血，分離血清，采用間接ELISA法監(jiān)測小鼠血清抗體效價，并用間接競爭ELISA法測定小鼠血清靈敏度，選擇效價、靈敏度均相對較高的血清對應(yīng)的小鼠進行最后一次加強免疫，免疫劑量為之前的2倍。
[0022]2.細胞融合
最后一次加強免疫3天后，米用50% (重量百分比)的聚乙二醇(PEG，分子量1460)作融合劑，按常規(guī)方法進行細胞融合。具體步驟如下:
將BALB/c小鼠脫頸處死，浸泡于