75%酒精中。約3 min后放入超凈臺(tái)。用鑷子提起小鼠腹部皮膚，用手術(shù)剪剪一個(gè)小口(注意勿剪破腹膜)，然后用鑷子向頭、尾兩個(gè)方向撕開(kāi)皮膚，充分暴露腹膜。換用干凈剪刀剪開(kāi)腹膜，取出脾臟，放入已盛有1mL不完全培養(yǎng)液的平皿中清洗一次，并剝?nèi)ソY(jié)締組織。將脾臟轉(zhuǎn)入另一盛有5 mL不完全培養(yǎng)液的平皿中，取一銅網(wǎng)，將脾臟置于銅網(wǎng)上，用注射器內(nèi)芯研磨脾臟，并用平皿內(nèi)的不完全培養(yǎng)液沖洗銅網(wǎng)，使脾細(xì)胞全部通過(guò)網(wǎng)孔進(jìn)入溶液中。將脾細(xì)胞溶液轉(zhuǎn)入50 ml離心管中，加不完全培養(yǎng)液至30 mL，混勻。1000 rpm離心5 min，棄上清。沉淀細(xì)胞再用不完全培養(yǎng)液離心一次，然后將細(xì)胞懸于10 ml完全培養(yǎng)液中，混勻。細(xì)胞計(jì)數(shù)，備用。
[0023]將骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞按1: 10的比例混合，在50 mL離心管中用DMEM培養(yǎng)基洗I次，1200 rpm離心8 min ;棄上清，用吸管吸凈殘留液體。用50%PEG融合，用含20%牛血清、1% HAT DMEM培養(yǎng)基重懸。將上述細(xì)胞，加到已有飼養(yǎng)細(xì)胞層的96孔板內(nèi)，每孔加100 μ L。將培養(yǎng)板置37°C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。DMEM培養(yǎng)基為含有2% (重量百分?jǐn)?shù))生長(zhǎng)因子的DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基購(gòu)于Hyclone公司，1%HAT (次黃嘌呤一氨基蝶呤一胸腺啼啶核苷購(gòu)于Gibco公司。
[0024]3.細(xì)胞株的篩選及克隆
待細(xì)胞融合后第10天左右，細(xì)胞集落長(zhǎng)到占孔底1/2面積大小，即可進(jìn)行抗體檢測(cè)。采用ELISA方法對(duì)有雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)孔進(jìn)行篩選，篩選分兩步進(jìn)行，第一步采用間接ELISA法篩選出抗雙酚A而不抗載體蛋白BSA的陽(yáng)性孔；第二步采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法對(duì)第一步篩選出的陽(yáng)性孔進(jìn)行檢測(cè)，用雙酚A作為競(jìng)爭(zhēng)原，選擇吸光值和靈敏度均較高的孔(吸光值較高指競(jìng)爭(zhēng)原為O的孔即陰性對(duì)照孔的最終測(cè)定值較高，靈敏度較高指抑制率為50%時(shí)的競(jìng)爭(zhēng)原濃度亦即IC 50值較小)，采用有限稀釋法將雜交瘤細(xì)胞克隆化，克隆后10天左右采用同樣的兩步法進(jìn)行檢測(cè)，如此重復(fù)克隆2次后，獲得雜交瘤細(xì)胞株BPA-4C7。
[0025]實(shí)施例2:抗體的制備、純化及鑒定
將實(shí)施例1獲得的將獲得的雜交瘤細(xì)胞株BPA-4C7注射預(yù)先用弗氏不完全佐劑處理過(guò)的BALB/c小鼠，收集該小鼠的腹水，純化處理后獲得抗雙酚A的單克隆抗體。
[0026]具體操作為:腹水于4°C 3000r/min離心5min以上，吸取上清，將上清與2倍體積的醋酸鹽緩沖液混合，邊攪拌邊緩慢加入正辛酸，每毫升腹水所需的正辛酸體積為33 yL，室溫混合30min，4°C靜置2h，使其充分沉淀。然后4°C 12000r/min離心30min，棄沉淀，將得到的上清液用砂芯漏斗過(guò)濾后，加入1/10濾液體積的0.lmol/L pH7.4的磷酸鹽緩沖液，用2 mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7.4，4 °C預(yù)冷I小時(shí)，緩慢加入0.277g/mL硫酸銨至硫酸銨終濃度為45%，4°C靜置2h，4°C 12000r/min離心30min，棄上清，將所得沉淀用原腹水體積1/10的0.01mol/L磷酸鹽緩沖液重懸，裝入透析袋，用0.01mol/L磷酸鹽緩沖液透析，將充分透析好的蛋白溶液加入等體積甘油，置_20°C冰箱中備用；
醋酸鹽緩沖液:0.29g醋酸鈉加入0.141mL醋酸，純水定容至10mL ；
0.lmol/L磷酸鹽緩沖液:0.8g氯化鈉，0.29g十二水磷酸氫二鈉，0.02g氯化鉀，0.02g磷酸二氫鉀，加水定容至100mL。
[0027]0.01mol/L磷酸鹽緩沖液:用純水將0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液稀釋10倍。
[0028]用常規(guī)非競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)法測(cè)得4C7的鼠腹水抗體的效價(jià)可達(dá)3.12X106，即腹水稀釋至3.12X106時(shí)測(cè)定結(jié)果為陽(yáng)性。用常規(guī)間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法鑒定其對(duì)雙酚A的半抑制濃度IC50為0.28 μ g/L,雙酚酸的交叉反應(yīng)率103%，與雙酚C的交叉反應(yīng)率9.9%，與己烯雌酚的交叉反應(yīng)率〈1%。
[0029]實(shí)施例3:抗體的應(yīng)用
將雜交瘤細(xì)胞株BPA-4C7分泌的抗雙酚A單克隆抗體用于雙酚A單克隆ELISA添加回收試驗(yàn)，具體步驟如下:
(I)包被:使用96孔聚苯乙烯酶標(biāo)板，用0.05mol/L pH 9.6的碳酸緩沖液將BPA-BSA稀釋到I μ g/mL，用多道可調(diào)式移液槍(簡(jiǎn)稱排槍)往每孔中加入100 μ L，加完后將酶標(biāo)板用保鮮膜蓋住，置于4°C過(guò)夜。
[0030](2)洗板:第二天，將酶標(biāo)板從4°C取出，使用PBST洗滌，每孔250 μ 1，洗滌4次，洗完后在毛巾上拍干。
[0031](3)封閉:用排槍往每孔中加入200 μ L 1% BSA的PBS，加完后將酶標(biāo)板用蓋蓋住，置于37°C放置2h。使用PBST洗滌，每孔250 μ 1，洗滌4次，洗完后在毛巾上拍干。
[0032](4)用 10% 甲醇配制 0,0.05,0.15,0.45、1.35,4.05 μ g/mL 的雙酚 A 標(biāo)準(zhǔn)溶液。將標(biāo)準(zhǔn)溶液及待檢測(cè)樣品提取液，分別加入已經(jīng)封閉好的酶標(biāo)板中，50mL/孔，每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)孔，再加入稀釋成1:8000雙酚A單克隆抗體50mL/孔，加入稀釋成1:4000酶標(biāo)二抗50mL/孔，輕輕拍打酶標(biāo)板后37 °C恒溫箱中反應(yīng)40min。
[0033](5)洗板:操作同上。
[0034](6)顯色:將顯色液A和顯色液B按1:1的體積比混合，用排槍加入混合好的顯色液10mL/孔，置37°C恒溫箱避光環(huán)境反應(yīng)lOmin。
[0035](7)測(cè)定:使用排槍加入2mol/L H2SO4 50mL/孔，輕輕振蕩酶標(biāo)板，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)450/630nm波長(zhǎng)處OD值。
[0036](8)添加回收率及樣品前處理:稱取4.5g水樣置于干凈的50mL玻璃三角瓶中，分別添加0.45、2、8 μ g BPA，加入0.5mL樣品稀釋液，蓋上蓋后振蕩5min，作為ELISA樣品提取液待測(cè)。采用直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA進(jìn)行添加回收率實(shí)驗(yàn)，回收率分別為106.8,81.5,101.3%。
[0037](9)溶液的配置:碳酸緩沖液:稱取Na2CO3 1.59g，NaHCO3 2.93g，加入純水至990mL，調(diào)pH至9.6，再用純水定容至1000mL，4°C貯存?zhèn)溆?。磷酸緩沖液(PBS): 8.5gNaCl, 2.2g Na2HPO412H20，0.2g NaH2P042H20，溶于 900mL純水中，調(diào)pH至7.4，定容至 lOOOmL。PBST:取500mL PBS，加入0.25mL吐溫20，混勻備用。
[0038]顯色液A:20mg TMB溶于1mL DMSO中，4°C保存，臨用前取出恢復(fù)至室溫，用純水稀釋至100mL。
[0039]顯色液B:21g —水合檸檬酸，71.1g Na2HP0412H20，2g過(guò)氧化氫尿素，加純水定容至 10OOmT,η
[0040]樣品提取液:取4g NaCl，溶于30mL水中，再加入70mL甲醇，混勻待用。
[0041 ] 酶標(biāo)二抗購(gòu)自于SoutherB1tech公司。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.雜交瘤細(xì)胞株BPA-4C7，其特征在于:已保藏于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號(hào)為CGMCC N0.10201。
2.權(quán)利要求1所述的雜交瘤細(xì)胞株BPA-4C7分泌的抗雙酚A單克隆抗體，其特征在于:它由所述的雜交瘤細(xì)胞株BPA-4C7所分泌產(chǎn)生。
3.權(quán)利要求2所述的抗雙酚A單克隆抗體的應(yīng)用，其特征在于在雙酚A分析檢測(cè)中的應(yīng)用，對(duì)雙酚A具有較好的親和力和檢測(cè)靈敏度，用于食品安全中雙酚A免疫檢測(cè)。
【專利摘要】本發(fā)明提供了雜交瘤細(xì)胞株4C7、其分泌產(chǎn)生的抗雙酚A單克隆抗體及其應(yīng)用。該雜交瘤細(xì)胞株4C7可以用于制備高效價(jià)雙酚A抗體，鼠腹水抗體酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)法測(cè)得的效價(jià)可達(dá)3.12×106；該抗雙酚A單克隆抗體靈敏度高，對(duì)雙酚A的50％抑制濃度即IC50為0.28μg/L，其用于測(cè)定雙酚A含量，實(shí)際應(yīng)用價(jià)值大。CGMCC No.1020120141212
【IPC分類】C07K16-44, G01N33-74, C12N5-20, G01N33-577
【公開(kāi)號(hào)】CN104762266
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510019495
【發(fā)明人】時(shí)國(guó)慶, 孫清, 鄧乾民
【申請(qǐng)人】北京科技大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年7月8日
【申請(qǐng)日】2015年1月15日