抗大鯢虹彩病毒單克隆抗體及其制備與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及免疫技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及抗大鯢虹彩病毒單克隆抗體及其制備與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]中國大鯛(Andrias davidianus)，俗稱娃娃魚，是世界上現(xiàn)存最大的瀕?危珍稀兩棲動物，為我國所特有、被列為國家二級保護(hù)野生動物，具有重要的科研價值及藥用和營養(yǎng)價值。由于人為捕獵和自然環(huán)境的改變等原因，野生大鯢數(shù)量急劇下降?；诒Ｗo(hù)和開發(fā)利用的目的，近年來大鯢的人工繁育與養(yǎng)殖在陜西、浙江、湖南、湖北、貴州等省份發(fā)展迅速，已經(jīng)形成具有重大經(jīng)濟(jì)價值的產(chǎn)業(yè)。隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大，病害發(fā)生日漸嚴(yán)重，成為大鯢升級養(yǎng)殖的瓶頸。2010年，在陜西漢中、四川綿陽等地發(fā)生了大面積的大鯢感染死亡事件，給大鯢養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。該病可在各種規(guī)格的養(yǎng)殖大鯢中發(fā)生，其死亡率可達(dá)90%以上。本實驗室研宄人員從主要患病癥狀為四肢末端及背部皮膚潰瘍、壞死的大鯢體內(nèi)分離到病毒，并對該病毒的理化及生物學(xué)特性進(jìn)行了研宄，基于感染試驗、細(xì)胞培養(yǎng)和分子生物學(xué)檢測等方法確定該病原為蛙病毒屬成員，故根據(jù)分離對象將其暫時命名為大魚兒虹彩病毒(Andrias davidianus ranavirus, ADRV)，定為ADRV 2010SX，并對該病毒株進(jìn)行了全基因組測序，已經(jīng)將測得的ADRV全基因序列提交到GenBank，登錄號為KF033124。
[0003]大鯢虹彩病毒對大鯢幼體和成體都具有較強的感染性和致死性。成鯢除了冬眠期夕卜，在其它季節(jié)均可發(fā)病，幼鯢的死亡率高達(dá)100%，成鯢的死亡率達(dá)80%以上。幼鯢和成鯢的臨床癥狀有所不同，成鯢主要表現(xiàn)為吻端潰瘍、腹部和尾部兩側(cè)皮下出血、四肢腫脹且末端潰爛，內(nèi)臟組織有出血點；幼鯢則主要表現(xiàn)為全身腫脹、腹部和內(nèi)臟組織有出血點。
[0004]近年來，我國科研人員陸續(xù)從不同地區(qū)發(fā)病的大鯢體內(nèi)分離到大鯢虹彩病毒，并對病毒的生物學(xué)特性、感染的病理學(xué)特征等進(jìn)行了分析，同時建立了 PCR、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(LAMP)、Taqman熒光PCR等分子生物學(xué)檢測方法，可檢測組織樣品中的大鯢虹彩病毒。然而，尚未開展基于大鯢虹彩病毒抗原或抗體的免疫學(xué)檢測方法。免疫學(xué)檢測方法的建立對于大鯢虹彩病毒感染的流行病學(xué)調(diào)查、診斷及生態(tài)保護(hù)具有重要意義。因此，從維持我國大鯢養(yǎng)殖業(yè)持續(xù)健康發(fā)展、保護(hù)珍稀物種以及保障生態(tài)多樣性出發(fā)，開展該病的免疫學(xué)檢測技術(shù)研宄勢在必行。
[0005]眾所周知，抗體是機體在抗原刺激下產(chǎn)生的能與該抗原特異性結(jié)合的免疫球蛋白。常規(guī)的抗體制備是通過動物免疫并采集抗血清的方法產(chǎn)生的，因而抗血清通常含有針對其他無關(guān)抗原的抗體和血清中其他蛋白質(zhì)成分。一般的抗原分子大多含有多個不同的抗原決定簇，所以常規(guī)抗體也是針對多個不同抗原決定簇抗體的混合物。即使是針對同一抗原決定簇的常規(guī)血清抗體，仍是由不同B細(xì)胞克隆產(chǎn)生的異質(zhì)的抗體組成。因而，常規(guī)血清抗體又稱為多克隆抗體，簡稱多抗。1975年，Kohler和Milstein建立了淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，他們把用預(yù)定抗原免疫的小鼠脾細(xì)胞與能在體外培養(yǎng)中無限制生長的骨髓瘤細(xì)胞融合，形成B細(xì)胞雜交瘤。這種雜交瘤細(xì)胞具有雙親細(xì)胞的特征，既像骨髓瘤細(xì)胞一樣在體外培養(yǎng)中能無限地快速增殖且永生不死，又能像脾淋巴細(xì)胞那樣合成和分泌特異性抗體。通過克隆化可得到來自單個雜交瘤細(xì)胞的單克隆系，即雜交瘤細(xì)胞系，它所產(chǎn)生的抗體是針對同一抗原決定簇的高度同質(zhì)的抗體，即所謂單克隆抗體，簡稱單抗。
[0006]與多抗相比，單抗純度高，專一性強、重復(fù)性好、且能持續(xù)地?zé)o限量供應(yīng)。單克隆抗體技術(shù)的問世，不僅帶來了免疫學(xué)領(lǐng)域里的一次革命，而且它在生物醫(yī)學(xué)科學(xué)的各個領(lǐng)域獲得及廣泛的應(yīng)用，促進(jìn)了眾多學(xué)科的發(fā)展。
[0007]由于大鯢虹彩病毒是大鯢疾病中首次分離到的病毒病原，也是中國有尾兩棲類動物中首次分離到的虹彩病毒，目前國內(nèi)針對該病原尚無任何免疫學(xué)檢測技術(shù)。因此，本發(fā)明擬在大量增殖并純化大鯢虹彩病毒的基礎(chǔ)上制備其單克隆抗體，以期為該病酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)等檢測方法的建立提供生物材料。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種抗大鯢虹彩病毒單克隆抗體、其制備方法及應(yīng)用。
[0009]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案:
[0010]本發(fā)明所提供的抗大鯢虹彩病毒單克隆抗體，是由保藏編號為CGMCCN0.9709的雜交瘤細(xì)胞株ADRV McAb 4C3分泌產(chǎn)生的。
[0011]本發(fā)明還提供了一種制備抗大鯢虹彩病毒單克隆抗體的方法，包括以下步驟:利用蔗糖密度梯度離心純化ADRV ;將純化病毒粒子作為抗原免疫動物(如小鼠)，取其脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞(如SP2/0細(xì)胞)融合制備雜交瘤細(xì)胞，經(jīng)篩選(例如采用間接ELISA對融合細(xì)胞進(jìn)行篩選)獲得可穩(wěn)定分泌抗大鯢虹彩病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，然后通過體內(nèi)或體外的方法制備單抗。例如，將雜交瘤細(xì)胞腹腔注射動物(如小鼠)，采集腹水，分離純化單抗，或通過體外培養(yǎng)該雜交瘤細(xì)胞，收集分泌產(chǎn)生的單克隆抗體。
[0012]經(jīng)篩選，本發(fā)明最終獲得可分泌抗大鯢虹彩病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞ADRVMcAb 4C3(單克隆抗體命名為4C3)，現(xiàn)已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址是中國北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中科院微生物研宄所，郵編100101)，其保藏編號為CGMCC N0.9709，分類命名為“雜交瘤細(xì)胞”，保藏日期2014年9月29日。
[0013]該雜交瘤細(xì)胞可用體內(nèi)或體外的方法大量制備抗大鯢虹彩病毒單克隆抗體4C3。用親和層析法純化單克隆抗體4C3，使用Protein G-Sepharose親和層析柱對單克隆抗體進(jìn)行純化。
[0014]本發(fā)明利用Western blot和間接免疫熒光試驗對單克隆抗體4C3進(jìn)行了免疫學(xué)鑒定。結(jié)果表明，制備的單克隆抗體4C3能夠特異性識別ADRV?？勾篥F虹彩病毒單克隆抗體4C3的成功制備，為大鯢虹彩病毒ELISA等檢測方法的建立奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。
[0015]本發(fā)明采用了間接ELISA對制備的單克隆抗體進(jìn)行了篩選。用純化的病毒粒子包被ELISA板，5%脫脂奶封閉，PBS洗滌，然后加入含有ADRV單克隆抗體的上清液；經(jīng)過一定時間反應(yīng)后，洗去未結(jié)合的抗體；再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG ;以TMB為底物進(jìn)行顯色。用2M H2SO4終止反應(yīng)后，通過酶標(biāo)儀來檢測結(jié)果。
[0016]本發(fā)明的優(yōu)點在于:
[0017](一 )本發(fā)明提供的抗大鯢虹彩病毒單克隆抗體4C3能夠特異性識別大鯢虹彩病毒。
[0018](二)本發(fā)明提供的抗大鯢虹彩病毒單克隆抗體4C3純度高，專一性強，重復(fù)性好，且能保證大量供應(yīng)。
[0019](三)本發(fā)明制備了大鯢虹彩病毒單克隆抗體4C3，為大鯢虹彩病毒ELISA等檢測方法的建立提供了優(yōu)選的生物材料。
【附圖說明】
[0020]圖1為本發(fā)明實施例1中純化的大鯢虹彩病毒粒子電鏡負(fù)染觀察結(jié)果，圖中標(biāo)尺為 10nm0
[0021]圖2為本發(fā)明實施例1中純化的大鯢虹彩病毒SDS-PAGE分析結(jié)果；其中，I為蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；2為純化的大鯛虹彩病毒。
[0022]圖3為本發(fā)明實施例4中單克隆抗體4C3與ADRV反應(yīng)的Western blot分析結(jié)果；其中，I為蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；2為純化的大鯢虹彩病毒；3為ADRV 2010SX感染的BF-2細(xì)胞；4為EHNV感染的BF-2細(xì)胞；5為未感染的BF-2細(xì)胞。
[0023]圖4為本發(fā)明實施例5中抗ADRV單克隆抗體4C3的間接免疫熒光分析結(jié)果；其中，A為ADRV 2010SX感染的BF-2細(xì)胞為未感染的BF-2細(xì)胞。
【具體實施方式】
[0024]為了更清楚地說明本發(fā)明，下面結(jié)合優(yōu)選實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，下面所具體描述的內(nèi)容是說明性的而非限制性的，不應(yīng)以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0025]實施例1大鯢虹彩病毒的純化
[0026]I病毒的增殖
[0027]本發(fā)明所使用的大鯛虹彩病毒(Andrias davidianus ranavirus, ADRV)，是由本實驗室成員從患病大鯢體內(nèi)分離到的，定為ADRV 2010SX，并對該病毒株進(jìn)行了全基因組測序，已經(jīng)將測得的ADRV全基因序列提交到GenBank，登錄號為KF033124。
[0028]將BF-2細(xì)胞接種于底面積為75cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，待形成匯合的單層細(xì)胞后接毒，接毒量為0.2mL (病毒效價為16TCID5tl)，按常規(guī)方法培養(yǎng)病毒，約90%以上的BF-2細(xì)胞形成完全的CPE后，收集細(xì)胞及上清，_80°C凍存?zhèn)溆谩?br>[0029]2病毒的超速離心
[0030]將上述感染ADRV的細(xì)胞混合液取出，反復(fù)凍融幾次使細(xì)胞完全破裂。4°C，8000rpm離心30min，去細(xì)胞碎片，收集上清與36% (w/v)蔗糖墊底(4:1)，24000rpm，4°C離心 2h (Beckman, JS-24)，病毒沉淀用適量 TNE 緩沖液(50mM Tris - HCl, 150mM NaCl, ImMdisodium EDTA, pH 7.4)重懸，即為初步純化病毒。懸液加到事先配好的30%、40%、50%和60% (w/v)的鹿糖梯度上。4°C，28000rpm離心2h (Beckman，SW41)。離心后，可見40%和50%蔗糖層之間出現(xiàn)乳白色的病毒條帶。將病毒條帶輕輕吸出，TNE緩沖液稀釋。4°C，24000rpm離心2h。最后收集病毒，TN緩沖液重懸病毒，_80°C保存。利用Bradford法測定純化病毒的濃度。
[0031]3電鏡觀察
[0032]吸取上述處理病毒液，滴加于覆蓋有Formvar膜的銅網(wǎng)上，吸附5_10m