in，用濾紙吸去多余液體，滴加3%磷鎢酸染色液，室溫5min，吸去多余染料，室溫下自然干燥后，將銅網(wǎng)于H-600A-2透射電鏡下觀察(圖1)。
[0033]4SDS-PAGE 分析
[0034]配制12%分離膠和5%濃縮膠，取純化的病毒溶液40 μ L與10 μ L5XSDS-PAGE上樣緩沖液混勻，沸水浴煮5min，12000rpm離心5min，收集上清液做SDS-PAGE，每個泳道的上樣量為10 μ L。電泳條件為:80V 30min、120V lh。純化的病毒粒子經(jīng)SDS-PAGE分析，結(jié)果顯示在考馬斯亮藍染色的凝膠上有明顯可見約20條蛋白條帶。此外病毒的主要蛋白都集中在分子量為26kDa以上的蛋白，26kDa以下的病毒蛋白，蛋白豐度較低(圖2)。
[0035]實施例2抗大鯢虹彩病毒單克隆抗體的制備
[0036]I BALB/c小鼠免疫流程
[0037]以純化后的大鯢虹彩病毒為免疫原免疫BALB/c小鼠。具體免疫程序及流程如下:
[0038]I)初次免疫:ADRV加弗氏完全佐劑皮下多點注射小鼠，10yg/只，200 μ L/只；完全佐劑，背部皮下多點免疫；
[0039]2)第二次免疫:1周后劑量減半，加弗氏不完全佐劑皮下多點注射小鼠；
[0040]3)第三次免疫:1周后劑量同上，加弗氏不完全佐劑皮下多點注射小鼠(5?7天后采血測其效價，檢測免疫結(jié)果)；
[0041]4)加強免疫:三免I周后加強免疫I次，劑量為100 μ g/只，皮下多點注射小鼠；
[0042]5)加強免疫3天后，無菌取脾細胞，制備脾細胞懸液。
[0043]2免疫脾細胞的制備
[0044]加強免疫3天后，無菌取脾細胞，制備脾細胞懸液，具體操作如下:
[0045]I)脫臼法處死小鼠；
[0046]2)將小鼠放于75%酒精中浸泡消毒后，以無菌剪刀剪開其腹部，取出脾臟，置于無菌的含少量培養(yǎng)液(1640培養(yǎng)液)的平皿中不銹鋼曬網(wǎng)上，用注射器針芯研磨成細胞懸液后計數(shù)；
[0047]3)冰上收集脾細胞懸液，離心去上清；
[0048]4)將沉淀用新鮮RPM1-1640培養(yǎng)液再次離心洗滌；
[0049]5)加入新鮮RPM1-1640培養(yǎng)液；計數(shù)脾細胞。
[0050]3骨髓瘤細胞的復(fù)蘇
[0051]骨髓瘤細胞SP2/0保存于_196°C液氮罐中，試驗時將其復(fù)蘇、增殖、傳代即可。在融合前48?36h，應(yīng)先用含15yg/mL 8-氮鳥嘌呤的培養(yǎng)基作擴大培養(yǎng)，取約I X 17?
5X 1VmL對數(shù)生長期的骨髓瘤細胞，在室溫離心(400rpm)10min，沉淀用2.5%胎牛血清(FCS)-1640培養(yǎng)液再懸浮離心，重懸混勻待用，并最后計數(shù)。
[0052]4飼養(yǎng)細胞的制備
[0053]在制備飼養(yǎng)細胞時，切忌針頭刺破動物的消化器官，否則所獲細胞會有嚴重污染。具體操作如下:
[0054]I)脫臼處死小鼠，75%酒精浸泡消毒1min ；
[0055]2)用手術(shù)剪將小鼠腹部剪開一小口，剝開皮膚，露出腹腔；
[0056]3)用注射器將4?5mL無血清RPM1-1640培養(yǎng)液注入腹腔，用手指輕柔按摩腹部，仍用該注射器回抽腹腔液體，移入離心管；
[0057]4) 100rpm 離心 lOmin，去上清；
[0058]5)用含20%小牛血清(NCS)的RPM1-1640培養(yǎng)液混懸，調(diào)整細胞數(shù)4X 105/mL ；
[0059]6)用ImL吸管將細胞加入96孔培養(yǎng)板，每孔0.05mL (含2萬個細胞)，放入37 °C、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，所得飼養(yǎng)細胞即可供細胞融合和克隆化之用。
[0060]5細胞融合
[0061]細胞融合的基本步驟是將骨髓瘤細胞與免疫細胞混合后，在PEG4000的作用下使兩種細胞彼此融合，將融合后的細胞適當稀釋，分置含滋養(yǎng)細胞的培養(yǎng)板中培養(yǎng)。具體操作如下:
[0062]I)將經(jīng)預(yù)先處理好的骨髓瘤細胞與免疫脾細胞按1:5的比例混合，在50mL塑料離心管內(nèi)用不完全培養(yǎng)液洗I次，1200rpm，8min ；
[0063]2)棄上清，用滴管吸凈殘留液體，以免影響PEG濃度。輕輕彈擊離心管底，使細胞沉淀略加松動；
[0064]3)將37°C水浴中保溫的50% PEG(分子量4000)0.5mL，緩慢滴入離心管，Imin內(nèi)加完，邊滴邊搖；
[0065]4)加預(yù)熱的不完全培養(yǎng)液，每隔2min分別加入lmL、2mL、3mL、4mL、5mL和10mL，終止PEG4000作用。
[0066]5)離心，800rpm，6min ;
[0067]6)棄上清，先用約6mL含20%小牛血清的RPM1-1640培養(yǎng)基(Gibco，美國)輕輕混懸，切忌用力吹打，以免使融合在一起的細胞散開；
[0068]7)用無菌吸管將融合后細胞懸液加入含有預(yù)先接種了滋養(yǎng)細胞的96孔板，100 μ L/孔，放入37°C、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
[0069]6HAT篩選雜交瘤
[0070]一般在融合24h后，加次黃嘌呤-氨甲喋呤-胸腺嘧啶核苷(HAT，Sigma，美國)選擇培養(yǎng)液。用時將ImL加入50mL含20%小牛血清的完全培養(yǎng)液中。由于脾細胞在體外培養(yǎng)條件下只能存活幾天，不影響雜交瘤細胞生長；而骨髓瘤細胞由于在葉酸抑制劑氨基蝶呤存在時無法合成嘌呤環(huán)合胸腺嘧啶甲基而不能合成DNA，同時又因為它是HGPRT-和TK-的缺陷型，無法利用培養(yǎng)液中的HGPRT和TK來合成DNA，因此骨髓瘤細胞在這種培養(yǎng)液中無法存活。這樣最后能在HAT培養(yǎng)液中存活的就只有雜交瘤細胞，因為它具有兩種親代細胞的染色體，可以產(chǎn)生原來脾細胞所具有的HGPRT，又從骨髓瘤細胞中獲得了在細胞培養(yǎng)基中長期生存繁殖的能力。
[0071]當HAT選擇培養(yǎng)液維持培養(yǎng)兩周后，改用HT培養(yǎng)液，再維持培養(yǎng)一周，改用一般培養(yǎng)液。通過選擇性培養(yǎng)而獲得的雜交細胞系中，僅少數(shù)能分泌針對免疫原的特異性抗體。一般在雜交瘤細胞布滿孔底1/10面積時，即可開始檢測特異性抗ADRV的抗體，篩選出所需要的高分泌的雜交瘤細胞系。
[0072]7雜交瘤細胞的克隆化
[0073]融合細胞呈克隆生長，經(jīng)有限稀釋后應(yīng)有36%的孔為I個細胞/孔。依據(jù)ELISA檢測篩選出高抗體分泌孔，將孔中細胞再行克隆化。克隆化的原則是，經(jīng)間接ELISA檢測為ADRV抗體陽性的雜交瘤細胞孔應(yīng)盡早進行克隆化，即使克隆化過的雜交瘤細胞也需要定期的再克隆。具體操作如下:
[0074]I)制備飼養(yǎng)細胞懸液(同融合前的飼養(yǎng)細胞準備)；
[0075]2)陽性孔細胞的計數(shù)，并調(diào)節(jié)細胞數(shù)在I X 13?5X10 VmL ；
[0076]3)取130個細胞放入6.5mL含飼養(yǎng)細胞完全培養(yǎng)液(即20個細胞/mL)，以100 μ L/孔加A、B、C三排，即為每孔2個細胞；余下2.9mL細胞懸液補加2.9mL含飼養(yǎng)細胞的完全培養(yǎng)液，細胞數(shù)為10個/mL，以100 μ L/孔加D、E、F三排，既為每孔I個細胞；余下
2.2mL細胞懸液補加2.2mL含飼養(yǎng)細胞的完全培養(yǎng)液，細胞數(shù)5個/mL，以100 μ L/孔，加G、H兩排，即為每孔0.5個細胞；
[0077]4)培養(yǎng)4?5天后，補加完全培養(yǎng)液200 μ L/孔；
[0078]5)第8?9天時，肉眼可見細胞克隆，及時進行抗ADRV的單克隆抗體的檢測。
[0079]將分泌抗體的陽性孔經(jīng)有限稀釋法進行3次亞克隆，獲得了 I株可以穩(wěn)定分泌抗ADRV單克隆抗體的雜交瘤細胞(命名為ADRV McAb 4C3)。
[0080]8抗ADRV單克隆抗體的腹水制備
[0081]篩選出的陽性抗ADRV雜交瘤細胞株應(yīng)及早進行單克隆抗體的大量制備。本試驗采用的是小鼠腹腔接種法，在小鼠體內(nèi)接種抗ADRV的雜交瘤細胞，制備腹水。具體操作如下:
[0082]I) BALB/c小鼠腹腔注射液體石蠟，0.5mL/只；
[0083]2) I?2周后，同法對上述小鼠進行腹腔注射I X 16個雜交瘤細胞；
[0084]3)接種細胞7?14天后可產(chǎn)生腹水，此時小鼠腹部明顯隆起，手觸有波動感，用16號針頭采集腹水；
[0085]4)將收集到的腹水1500rpm，離心30min，及時純化。
[0086]9抗ADRV單克隆抗體的純化
[0087]腹水中的特異性抗ADRV的抗體濃度較抗血清中的濃度高，純化效果好。本試驗采用的是Protein G-Sepharose親和層析進行抗體純化，具體操作如下:
[0088]I)平衡:用Binding Buffer (20mmol/L、pH7.0PBS)平衡蛋白G親和柱至基線平穩(wěn);
[0089]2)上樣:將腹水樣品上柱，收集流穿液；將流穿液再次上柱，繼續(xù)平衡至基線平穩(wěn);
[0090]3)洗脫:加入洗脫緩沖液進行洗脫，收集洗脫峰，SDS-PAGE檢測純度；
[0091 ] 4)用0.01M, pH7.2PBS透析收集的洗脫峰，使純化后的抗體保存在0.01M,pH7.2PBS環(huán)境中；
[0092]5)用蛋白定量檢測儀測定純化后單克隆抗體4C3的濃度。結(jié)果表明，單克隆抗體4C3的濃度分別為1.5mg/mL。
[0093]10陽性雜交瘤細胞培養(yǎng)上清的抗體亞型的鑒定
[0094]抗體亞型的檢測試劑盒由Southern B1tech公司生產(chǎn)，具體實驗方法參照廠家說明書。鑒定結(jié)果表明，單克隆抗體4C3的亞型為IgGl。
[0095]11單克隆抗體特異性檢測
[0096]用純化的單克隆抗體4C3分別與其他病毒:傳染性造血組織壞死病毒(IHNV)、鯉春病毒血癥病毒(SVCV)