一株耐高溫高濕的布拉迪酵母菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一株耐高溫高濕的布拉迪酵母菌及其應(yīng)用，屬于微生物領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 布拉迪酵母菌，又稱布拉氏酵母（Saccharomycesboulardii)屬于釀酒酵母的一 個(gè)亞種，其沒有病原性，能在37°C高溫下良好生長，并具有獨(dú)特的生物活性。布拉迪酵母菌 能夠有效地治療人和動物的各種腹瀉，且未發(fā)現(xiàn)不良反應(yīng)。布拉迪酵母菌進(jìn)入人和動物腸 道后，不僅可W降解致病菌產(chǎn)生的毒素和中和細(xì)菌毒素，還能夠刺激腸道黏膜從而增強(qiáng)免 疫功能，同時(shí)調(diào)節(jié)腸道內(nèi)微生態(tài)環(huán)境的平衡，阻止病原菌的侵襲，且布拉迪酵母菌制劑屬于 天然微生態(tài)制劑，不僅無毒副作用，還可W提供一定的營養(yǎng)物質(zhì)。因此，布拉迪酵母菌在畜 牧業(yè)上的應(yīng)用越來越廣泛。
[0003] 布拉迪酵母菌作為益生菌中唯一的真菌，對提高畜禽生長性能有顯著效果，可用 于改善單胃動物營養(yǎng)和健康的飼料添加劑。但是布拉迪酵母菌在生長過程中，不形成芽胞， 抗逆性較差，在液體條件下難W長期保存。在體內(nèi)，作為外源菌，受胃腸道環(huán)境影響較大，容 易丟失活性，從而失去其益生功效。
[0004] 中國專利文獻(xiàn)CN104388325A公開了一株飼用布拉氏酵母，命名為：布拉氏酵 母（Saccharomycesboulardii)SH94,保藏號為CCTCCNo;M2014211。上述布拉氏酵母 從華中農(nóng)業(yè)大學(xué)果園根際上壤中分離，并應(yīng)用于制備仔豬飼料添加劑。所述布拉氏酵母 (Saccharomycesboulardii)SH94具有較強(qiáng)的耐胃液腸液的能力，但是其在40°C處理化， 存活率達(dá)到60%，在70°C處理2min及在80°C處理30s后，存活率維持在60%，該菌株具有 一定的耐熱能力，但是耐熱性不是很強(qiáng)。在實(shí)際應(yīng)用中，布拉氏酵母產(chǎn)品在添加使用于配合 顆粒飼料時(shí)，往往要經(jīng)過高溫高濕的制粒處理，此過程中布拉氏酵母活性會大量的喪失，會 導(dǎo)致產(chǎn)品中有效成分損失較大，產(chǎn)品的保質(zhì)期也較短，限制了其大規(guī)模應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為此，本發(fā)明針對于現(xiàn)有技術(shù)中布拉迪酵母菌在添加入飼料時(shí)高溫高濕處理過程 中活性降低的問題，提供一株耐高溫高濕的布拉迪酵母菌。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用W下技術(shù)方案：
[0007]一株耐高溫高濕的布拉迪酵母菌（Saccharomycesboulardii)，其保藏編號為 CGMCCNo. 10381，該菌株已于2015年1月21日送至中國微生物菌種保藏管理委員會普通 微生物中屯、（簡稱CGMCC)保藏，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號。
[000引 所述耐高溫高濕的布拉迪酵母菌（Saccharomycesboulardii)通過W下方法分離 篩選得到：
[0009]將慕枝皮粉碎，并將一定量慕枝皮粉碎物在含有50yg/mL氨節(jié)青霉素的（YPD) 液體培養(yǎng)基中28°C好氧培養(yǎng)至培養(yǎng)基呈混濁狀態(tài)，取適當(dāng)培養(yǎng)及稀釋后涂平板，根據(jù)菌落 形態(tài)挑取典型酵母菌單菌落（白色，大小l-2mm，濕潤隆起，有酒香味），通過鏡檢粗篩出酵 母菌。通過生理生化、16SrDNA測序分析，最終篩選到一株布拉氏酵母（Saccharomyces boulardii)。該菌株已于2015年1月21日送至中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生 物中屯、保藏，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號。其保藏編號為CGMCCNo. 10381，建 議的分類名為布拉迪酵母菌（Saccharomycesboulardii)。
[0010] 該菌株具體有典型的布拉氏酵母形態(tài)特征：該菌株在YTO瓊脂糖固體培養(yǎng)基上繁 殖形成的菌落為圓形，大而濕潤，呈乳白色，光滑，邊緣清晰，生長迅速；鏡檢顯示細(xì)胞個(gè)體 較大，呈近球形，多邊芽殖。
[0011] 生理生化特征：發(fā)酵葡萄糖。耐熱能力實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示布拉迪酵母菌在100%濕度、 751：和851：下處理1111111(圖4)后，菌粉產(chǎn)品在100%濕度751：和851：處理1111111存活率分 別可達(dá)58. 4%和57. 9%。在110°C和130°C高溫下分別處理30s、45s和60s，結(jié)果表明，該 布拉迪酵母菌存活率保持在64-83% (圖4B)。耐人工胃液和腸液能力實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示布拉 迪酵母菌在抑2. 0的人工合成胃液中處理30min、90min和ISOmin后存活率降至29. 1%、 23. 5%和18. 2%巧A)。在模擬腸液中處理30min、90min和ISOmin后，布拉迪酵母菌存活 率降至80. 61 %、65. 42%和41.68%。W上生理生活化結(jié)果表明，該布拉迪酵母菌具有很好 的高溫高濕耐受力和較高的腸環(huán)境耐受力。但胃環(huán)境耐受力較弱。
[0012] 一種布拉迪酵母菌添加劑，含有上述的布拉迪酵母菌。
[0013] 上述布拉迪酵母菌添加劑中，含有上述布拉迪酵母菌的微膠囊。
[0014] 上述布拉迪酵母菌添加劑中，所述布拉迪酵母菌的微膠囊的制備方法包括步驟如 下：
[0015] (1)將布拉迪酵母菌菌液加入到海藻酸鋼-碳酸巧溶液中，得到濃度為 IX106c化/mL菌液作為水相；將表面活性劑SpanSO分散于液體石蠟中作為油相，往油相中 加入水相，W4(K)巧m攬拌5min形成穩(wěn)定的乳化液；向其中加入冰醋酸酸解碳酸巧解離出 Ca2+，與海藻酸鋼產(chǎn)生凝膠化反應(yīng)，形成海藻酸巧微膠囊，固定化時(shí)間為lOmin;最后去離子 水多次沖洗，通過分液漏斗分離沉降海藻酸巧微膠囊；
[0016] (2)將海藻酸巧微膠囊加入到培養(yǎng)基中，培養(yǎng)微膠囊化的布拉迪酵母菌至菌體充 滿微膠囊內(nèi)部80% W上的空間，過濾分離得到微膠囊。
[0017] 一種布拉迪酵母菌微膠囊培養(yǎng)方法，將上述的布拉迪酵母菌包于微膠囊中，然后 在YTO培養(yǎng)基中，28 °C下，好氧培養(yǎng)微膠囊化的布拉迪酵母菌。
[001引上述述的耐高溫高濕的布拉迪酵母菌或上述布拉迪酵母菌添加劑在制備動物飼 料添加劑中的用途。
[0019] 上述用途中，所述動物為肉雞。
[0020] 上述耐高溫高濕的布拉迪酵母菌或上述布拉迪酵母菌添加劑在家禽飼養(yǎng)中作為 抗生素使用的用途。
[0021] 上述的耐高溫高濕的布拉迪酵母菌或上述布拉迪酵母菌添加劑在制備抗生素藥 物中的用途。
[0022] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有W下優(yōu)點(diǎn)：
[0023] 1、本發(fā)明的保藏編號為CGMCCNo. 10381的布拉迪酵母（Saccharomyces boulardii)具有較高的活性，其株增殖速度、最大生物量（即菌體最終密度）都顯著高于同 類釀酒酵母菌株，并且具有很強(qiáng)的耐高溫耐濕的能力；本發(fā)明的布拉迪酵母菌在100%濕 度75°C和85°C處理Imin存活率分別可達(dá)58. 4%和57. 9%;在110°C和130°C高溫下分別 處理30s、45s和60s，存活率保持在64-83 %，上述耐高溫耐濕的能力使本發(fā)明的布拉迪酵 母作為飼料添加劑在進(jìn)行高溫高濕處理過程中保存較高的活性。
[0024] 2、本發(fā)明的布拉迪酵母菌添加劑含有布拉迪酵母菌的微膠囊，為了提高本申請的 布拉迪酵母的胃腸環(huán)境能力耐受性，將布拉迪酵母菌進(jìn)行微囊化，提供了布拉迪酵母菌微 膠囊，所述布拉迪酵母菌微膠囊；（1)將布拉迪酵母菌通過微囊化轉(zhuǎn)變成一種穩(wěn)定的細(xì)粉 顆粒，改變微生態(tài)制劑產(chǎn)品的形態(tài)，該種微膠囊產(chǎn)品具有良好的流動性和分散性，很容易與 其它飼料混合均勻，便于運(yùn)輸、貶存和添加使用；（2)微膠囊化后的酵母菌耐酸性和熱穩(wěn)定 性得到提高，由于微膠囊的保護(hù)，能夠有效地防止菌體失活，提高布拉迪酵母菌產(chǎn)品的穩(wěn)定 性。在體內(nèi)，還能防止胃液的破壞，從而使盡可能多的菌體到達(dá)腸道，真正起到保健和治療 的作用；（3)可將配伍禁忌的各種成分在同一產(chǎn)品中隔開。（4)使不溶于水的物質(zhì)能均勻地 分散在水溶性介質(zhì)中。本發(fā)明的微膠囊對畜禽均無毒副作用，且來源廣，價(jià)格便宜可作為飼 料添加劑替代抗生素使用，可提高肉雞的日增重、免疫器官指數(shù)、疾病抵抗力、抗氧化性、免 疫球蛋白。
【附圖說明】
[0025] 下面結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，并非對發(fā)明的限定，依照 本領(lǐng)域公知的現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的實(shí)施方式并不限于此，因此凡依照本文公開內(nèi)容所作出 的本領(lǐng)域的等同替換，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0026] 圖1布拉迪酵母與普通釀酒酵母生長曲線，每隔化測定菌體密度（n= 3， 沖<0.0巧。
[0027] 圖2微囊化和游離布拉迪酵母生長曲線，每隔化測定菌體密度（n= 3,沖<0.05)。 [002引圖3微囊化布拉迪酵母發(fā)酵前后對比。
[0029] 圖4微囊化和游離布拉迪酵母在高溫高濕條件下存活率。（n= 3,沖<0. 05， *沖<0. 01)。
[0030] 圖5微囊化和游離布拉迪酵母菌在模擬胃液和腸液中存活率。（n= 3,沖<0. 05， *沖<0. 01)。
【具體實(shí)施方式】
[0031] 實(shí)施例1 ;微囊化布拉迪酵母菌及其生長曲線
[0032] 一、方法；
[003引1.生長活性比較；
[0034] 本發(fā)明布拉迪酵母為一種釀酒酵母，將之與普通釀酒酵母（(Saccharomyces cerevisiae)，購于ATCC)進(jìn)行生長活性對比。
[0035] 方法如下：將活化兩代的待測菌株W1%的接種量（約2X106c化/mL)接種于裝有 lOOmLYro培養(yǎng)基的300血S角瓶中，28°C，180巧m培養(yǎng)，每2小時(shí)取樣，測定600皿處吸光 值。W培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的吸光值為縱坐標(biāo)，繪制生長曲線。
[0036] 為了提高本申請的布拉迪酵母的胃腸環(huán)境能力耐受性，將布拉迪酵母菌進(jìn)行微囊 化，制備布拉迪酵母菌微膠囊。
[0037] 其中，布拉迪酵母菌微膠囊的制備方法如下：
[003引按與海藻酸鋼一定的質(zhì)量比（1 ;1.5)，稱取碳酸巧，分散于少量蒸饋水中，然后加 入一定濃度完全溶解的海藻酸鋼溶液（海藻酸鋼濃度為l-2g/L)，攬拌均勻，并加入布拉迪 酵母菌菌液，使其初始接種濃度為1X106c化/mU作為水相；表面活性劑SpanSO充分分散 于液體石蠟中作為油相，按一定水油兩相體積比值（1 ;5-6)，往油相中加入水相，W4(K)巧m 攬拌5min形成穩(wěn)定的乳化液；向其中加入冰醋酸酸解碳酸巧解離出Ca2+，與海藻酸鋼產(chǎn)生 凝膠化反應(yīng)，形成海藻酸巧微膠囊，固定化時(shí)間為lOmin;最后去離子水多次沖洗，通過分 液漏斗分離沉降海藻酸巧微膠囊，將適于微膠囊產(chǎn)品加入到Y(jié)TO培