養(yǎng)基中，培養(yǎng)微膠囊化 的微生物至微生物細胞充滿微膠囊內部80 %W上的空間，過濾分離得到濕微膠囊產品。
[0039] 微囊化酵母菌生長曲線測定：根據0D600調整相同菌體密度的游離（未包被）和 微囊化釀酒酵母轉移到YTO液體培養(yǎng)基中，28°C，ISOrpm好氧培養(yǎng)1化；每個處理S個平行。 每隔化測定其0D600值，對于微囊化包埋和游離培養(yǎng)的酵母菌，分別W空膠囊和空白培養(yǎng) 基作為空白對照。最后用紫外分光光度計測定其0D600值。
[0040]二、結果
[0041] 結果如圖1所示。本申請所篩得布拉迪酵母菌株增殖速度、最大生物量（即菌體 最終密度）都顯著高于同類菌株。
[0042] 微囊化布拉迪酵母菌經發(fā)酵培養(yǎng)后，得到產品活菌數分別大5. 5Xl〇Wc化/g。圖2 顯示的是游離和微囊化布拉迪酵母菌生長曲線圖，布拉迪酵母經微囊化和游離培養(yǎng)兩種方 式進入生長穩(wěn)定期時間分別是化和化（圖2)，在第0和化，布拉迪酵母在微囊化和游離兩 種方式下，菌體生長密度差異不顯著（P〉〇. 05)，但在第化起，微囊化布拉迪酵母的菌體密 度顯著高于游離培養(yǎng)釀酒酵母（P<〇. 05)，釀酒酵母經微囊化后最高菌體密度是游離培養(yǎng)的 1. 76 倍。
[0043] 圖3顯示的是微囊化布拉迪酵母發(fā)酵前與發(fā)酵后的形態(tài)及其粒徑分布圖。由圖可 見，微囊化布拉迪酵母的粒徑大小較均勻，球形度好，能隱約看到有菌體在微膠囊中分布； 經發(fā)酵培養(yǎng)后菌體長滿了微膠囊，菌體密度很大。微囊化布拉迪酵母發(fā)酵前表面結構平滑， 而經發(fā)酵培養(yǎng)W后，微生物在微膠囊表面各部位擠壓空間大量繁殖，盡管兩者均有輕微膨 脹，但都沒發(fā)現破囊現象。
[0044] 實施例2體外評價實驗
[0045] 一.方法
[0046] 1)微囊化布拉迪酵母及其培養(yǎng)方法同上。
[0047] 2)體外評價實驗
[0048] ①在恒溫干燥箱中對微囊化布拉迪酵母菌進行高溫耐受性評價，Ig微囊化布拉迪 酵母菌在110°C和130°C下分別處理30s、45s和60s，W未包被布拉迪酵母菌菌粉作為對 照。此外，微囊化布拉迪酵母菌和布拉迪酵母菌菌粉在100%濕度，75°C和85°C條件下處理 Imin。微囊化布拉迪酵母菌需經破囊后通過梯度稀釋平板傾注法進行活菌計數，釀酒酵母 和尿腸球菌分別于YTO和MRS瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)4她，統(tǒng)計活菌數，每個處理做S個重復。
[0049] ②模擬胃液耐受性實驗，將0. 5g微囊化布拉迪酵母菌和布拉迪酵母菌菌粉兩種 樣品轉移到預熱的裝有4. 5血模擬胃液試管中，37°C80巧m處理0min、30min、90min和 ISOmin。結束后加入破囊液中和抑值同時釋放布拉迪酵母菌，梯度稀釋，傾注法進行活菌 計數，每個處理=個重復。
[0050] ⑨模擬腸液耐受性實驗，將0. 5g微囊化布拉迪酵母菌和布拉迪酵母菌菌粉兩種 樣品轉移到預熱裝有4. 5血模擬腸液的試管中，37°C80巧m處理0min、30min、90min和ISOmin。結束后加入破囊液中和抑值同時釋放益生菌并進行活菌計數，梯度稀釋，傾注法 進行活菌計數，每個處理=個重復。
[0化1] 人工胃液的配制方法：在16. 4血質量分數為0.化g/L的鹽酸中加入蒸饋水調節(jié) 抑至2. 0。每lOOmL溶液中加入Ig胃蛋白酶，待其充分溶解后，用0. 22um的微孔濾膜除菌。 [0化引人工腸液的配制方法：取6. 8gKH2P04于500血蒸饋水中溶解，W質量分數4g/ LNaOH緩沖液調節(jié)溶液抑值至6.8,定容至lOOOmL。每lOOmL溶液中加入Ig膜蛋白酶，待 其充分溶解后，用0.22um的微孔濾膜除菌。
[0053]二.結果
[0化4] 布拉迪酵母菌粉及微囊化布拉迪酵母菌在100 %濕度、75 °C和85 °C下處理 Imin(圖4)后，菌粉產品在100%濕度75°C和85°C處理Imin存活率分別下降了 41.6%和 42. 1%。而微囊化的釀酒酵母僅分別下降了 12. 3%和16. 5%。相比菌粉，微囊化后的酵母 存活率分別提高了 29. 2%和25. 3% (P<0. 01)(圖4A)。在110°C和130°C高溫下分別處理 30s、45s和60s，結果表明：隨著溫度升高和處理時間延長，存活率逐漸下降，在110°C下處 理30s，130°C分別處理30s、微囊化的布拉迪酵母存活率顯著高于菌粉（P<0. 05)，在130°C 分別處理45s和60s后都極顯著高于未包的菌粉（P<0. 01)，存活率保持在80-90 % (圖4B)。 [0化5] 圖5顯示的是微囊化布拉迪酵母及菌粉在模擬胃腸液中的耐受性評價。酵母菌粉 在模擬胃液處理30min、90min和ISOmin后存活率降至29. 1%、23. 5%和18. 2% (圖5A)。 經微膠囊包埋后存活率分別為89. 1 %、82. 1 %和74.6%，該意味著微膠囊包埋后，存活率 分別提高了 60. 4%、59. 2%和56. 7% (P<0. 01)。在模擬腸液中也得到相似的結果，微囊化 后布拉迪酵母在模擬腸液中處理30min、90min和ISOmin后，相比菌粉存活率分別提高了 16. 1%、15. 4%和25.6% (P<0. 01)(圖5B)，該說明布拉迪酵母難W在低抑值和高膽鹽濃 度下存活，而微膠囊包埋具有良好的保護作用，可W提高其通過胃腸道后的存活率。
[0056] 實施例3;肉雞飼養(yǎng)試驗
[0057] -、方法；
[0化8] 試驗動物；1日齡AA肉雞公維，隨機選取400只，隨機分成4個處理組，每組5個 重復，每個重復20只雞。試驗日糧分別為；A.空白對照組（基礎日糧組）化基礎日糧+lg抗生素（Aureomycin) /kg日糧；C基礎日糧+108c化微囊化布拉迪酵母菌/kg日糧。試驗 期為42山1-2Id為試驗前期，22-42d為試驗后期，基礎日糧為玉米-豆稍型，參照中國肉雞 飼養(yǎng)標準（2004)分2階段配制。
[0059] 生長性能
[0060] 分別于試驗的第1天、第21天、第42天W各重復為單位空腹稱重，記錄試驗前期 和試驗后期的耗料量和死淘數，計算試驗前期、試驗后期和試驗全期各重復的平均日增重 (ADG)、平均日采食量（ADFI)和料重比（F/G)。
[0061] 免疫器官指數
[0062] 分別于21、42日齡，從每個重復抽取3只與平均體重相近的試驗雞，稱重后頸部放 血屠宰，取脾臟和法氏囊，并稱重，計算免疫器官指數；免疫器官相對重量=免疫器官重量 /活體重量X100%
[0063] 抗氧化能力
[0064] 分別于21、42日齡，從每個重復抽取3只與平均體重相近的試驗雞，頸部采血， 300化pm離屯、lOmin后分離得到血清，參考南京建成生物工程研究所提供的試劑盒測 定方法測定第21日齡和42日齡收集的血清中總超氧化物歧化酶（TotalSuperoxide dismutase，T-S孤）和丙二醒（Malondialdehyde，MDA)的含量。
[00化]二、結果
[0066] 由表1可見；實驗前期（1-21天），微膠囊組和抗生素組日增重顯著高于對照組， 其他無顯著差別。證明微囊化布拉迪酵母菌在提高肉雞日增重方面可替代抗生素。
[0067] 表1微囊化布拉迪酵母菌對肉雞日增重、采食量及飼料轉化率的影響（n= 15)
[0068]
【主權項】
1. 一株耐高溫高濕的布拉迪酵母菌（Saccharomycesboulardii)，其保藏編號為CGMCC No.10381。
2. -種布拉迪酵母菌添加劑，其特征在于，含有權利要求1所述的布拉迪酵母菌。
3. 根據權利要求2的布拉迪酵母菌添加劑，其特征在于，含有權利要求1所述的布拉迪 酵母菌的微膠囊。
4. 根據權利要求3所述的布拉迪酵母菌添加劑，其特征在于，所述布拉迪酵母菌的微 膠囊的制備方法包括步驟如下： (1) 將布拉迪酵母菌菌液加入到海藻酸鈉-碳酸鈣溶液中，得到濃度為IXlO6CfuAiL 菌液作為水相；將表面活性劑Span80分散于液體石蠟中作為油相，往油相中加入水相，以 400rpm攪拌5min形成穩(wěn)定的乳化液；向其中加入冰醋酸酸解碳酸鈣解離出Ca2+，與海藻酸 鈉產生凝膠化反應，形成海藻酸鈣微膠囊，固定化時間為IOmin;最后去離子水多次沖洗， 通過分液漏斗分離沉降海藻酸鈣微膠囊； (2) 將海藻酸鈣微膠囊加入到培養(yǎng)基中，培養(yǎng)微膠囊化的布拉迪酵母菌至菌體充滿微 膠囊內部80 %以上的空間，過濾分離得到微膠囊。
5. -種布拉迪酵母菌微膠囊培養(yǎng)方法，其特征在于，將權利要求1所述的布拉迪酵母 菌包于微膠囊中，然后在YH)培養(yǎng)基中，28 °C下，好氧培養(yǎng)微膠囊化的布拉迪酵母菌。
6. 權利要求1所述的耐高溫高濕的布拉迪酵母菌或權利要求2-4任一項所述布拉迪酵 母菌添加劑在制備動物飼料添加劑中的用途。
7. 根據權利要求6所述的用途，其特征在于，所述動物為肉雞。
8. 權利要求1所述的耐高溫高濕的布拉迪酵母菌或權利要求2-4任一項所述布拉迪酵 母菌添加劑在家禽飼養(yǎng)中作為抗生素使用的用途。
9. 權利要求1所述的耐高溫高濕的布拉迪酵母菌或權利要求2-4任一項所述布拉迪酵 母菌添加劑在制備抗生素藥物中的用途。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株耐高溫高濕的布拉迪酵母菌及其應用，屬于微生物領域。本發(fā)明的耐高溫高濕的布拉迪酵母菌(Saccharomyces boulardii)，其保藏編號為CGMCC No.10381，所述布拉迪酵母菌其株增殖速度、最大生物量(即菌體最終密度)都顯著高于同類釀酒酵母菌株，并且具有很強的耐高溫耐濕的能力，使本發(fā)明的布拉迪酵母可以作為飼料添加劑，并在進行高溫高濕處理過程中保存較高的活性。本發(fā)明的布拉迪酵母菌微膠囊可提高肉雞的日增重、免疫器官指數、疾病抵抗力、抗氧化性、免疫球蛋白，并且對畜禽均無毒副作用，且來源廣，價格便宜可作為飼料添加劑替代抗生素使用。CGMCC No.1038120150121
【IPC分類】C12N1-16, A61K36-064, C12N11-10, C12R1-85, A23K1-17, C12N11-04, A61P31-00, A23K1-18
【公開號】CN104774776
【申請?zhí)枴緾N201510197846
【發(fā)明人】魏永剛
【申請人】魏永剛
【公開日】2015年7月15日
【申請日】2015年4月23日