抗美沙酮代謝物eddp雜交瘤細(xì)胞株及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種抗美沙酮代謝物EDDP雜交瘤細(xì)胞株及 其產(chǎn)生的單克隆抗體的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 美沙酮代謝物EDDP即為美沙酮在肝臟內(nèi)經(jīng)生物轉(zhuǎn)化，通過(guò)去甲基化形成無(wú)藥理 活性的吡咯烷（pyrrolidine)衍生物，其化學(xué)名為2-亞乙基-1，5-二甲基-3, 3-二苯基吡 咯烷（EDDP)。
[0003] 美沙酮是一種人工合成的麻醉藥品，屬于國(guó)家嚴(yán)格管制的麻醉藥品之一。美沙酮 可以用來(lái)治療海洛因及鴉片成癮。美沙酮是一種長(zhǎng)效阿片類藥物，和海洛因等毒品不同，吸 毒人員服用美沙酮后，不會(huì)產(chǎn)生對(duì)毒品的依賴，也就是說(shuō)不會(huì)產(chǎn)生毒品戒斷后的痛苦癥狀， 由于美沙酮是特殊藥品，所以對(duì)它的保管特別嚴(yán)格，一旦有人非法帶出醫(yī)院，將視為攜帶毒 品送交公安部門處理。通過(guò)檢測(cè)美沙酮代謝物EDDP來(lái)確定是否服用美沙酮。
[0004] 現(xiàn)有技術(shù)中，美沙酮可以采用儀器分析。儀器分析依賴技術(shù)要求高、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、 成本高，檢測(cè)結(jié)果可靠性不高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種抗美沙酮代謝物EDDP雜交瘤細(xì)胞株。
[0006] 本發(fā)明抗美沙酮代謝物EDDP雜交瘤細(xì)胞株命名為雜交瘤細(xì)胞株9G2. 5,于2015年 1月15日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（China Center for Type Culture Collection， 簡(jiǎn)稱CCTCC)，保藏號(hào)為CCTCC N0:C201507;保藏地址是中國(guó)武漢武漢大學(xué)。該雜交瘤細(xì)胞 株能夠產(chǎn)生高特異性的抗美沙酮代謝物EDDP單克隆抗體，生產(chǎn)效率高，成本低。
[0007] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供雜交瘤細(xì)胞株9G2. 5分泌的抗美沙酮代謝物EDDP單 克隆抗體。該單克隆抗體具有較高的特異性、敏感性，交叉反應(yīng)率低。
[0008] 本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供抗美沙酮代謝物EDDP單克隆抗體的制備方法，包括 步驟如下：
[0009] 步驟（1).小鼠免疫
[0010] 選擇8周齡的BALB/c雌鼠用美沙酮代謝物EDDP人工抗原注射小鼠后小腿肌肉； 所述的后小腿肌肉部位為小鼠腿部暴露在外部有大塊肌肉的地方，而小鼠的大腿大部分被 腹部皮膚包裹，也可找到膝關(guān)節(jié)區(qū)分小腿大腿；
[0011] 取8周齡的BALB/c雌鼠，用美沙酮代謝物EDDP人工抗原注射小鼠后小腿肌肉，每 隔1周注射一次，共注射4次；第一次美沙酮代謝物EDDP人工抗原免疫量為20 y g/只，第 一次美沙酮代謝物EDDP人工抗原免疫之前進(jìn)行抗原乳化步驟，抗原乳化步驟是將美沙酮 代謝物EDDP人工抗原免疫量稀釋于20ulPBS緩沖液中，得到稀釋抗原，與等體積量的弗氏 完全佐劑乳化；后續(xù)二次美沙酮代謝物EDDP人工抗原免疫量為20ug/只，抗原乳化步驟與 第一次相同；最后1次美沙酮代謝物EDDP人工抗原免疫量改為5ug/只，抗原乳化步驟與第 一次相同。
[0012] 步驟（2).淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的融合
[0013] 2-1.飼養(yǎng)細(xì)胞制備：小鼠摘眼球處死，浸泡于75 %酒精中消毒，撕開小鼠腹外皮 膚，暴露其腹膜，注入37°C預(yù)熱的IMDM無(wú)血清培養(yǎng)基，輕揉小鼠腹腔，懸浮腹腔細(xì)胞，吸出 腹腔液；離心，沉淀物用1XHAT的IMDM培養(yǎng)液重懸，得到飼養(yǎng)細(xì)胞懸液。
[0014] 2-2.小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0的培養(yǎng)：把小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0用含體積分?jǐn)?shù)為 10 % FBS的IMDM培養(yǎng)基進(jìn)行傳代培養(yǎng)，細(xì)胞融合前一天進(jìn)行傳代以保證小鼠骨髓瘤細(xì)胞 SP2/0適合生長(zhǎng)狀態(tài)良好用于細(xì)胞融合。
[0015] 2-3.淋巴細(xì)胞制備：取經(jīng)步驟⑵處理的BALB/c雌鼠靠近淋巴結(jié)皮下部位的淋 巴結(jié)，研磨淋巴細(xì)胞至懸液；淋巴細(xì)胞懸液離心，取沉淀；在沉淀中加入MDM培養(yǎng)基，調(diào)整 淋巴細(xì)胞的濃度至1 X 107個(gè)/mL。
[0016] 2-4.淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合：采用聚乙二醇融合法。將調(diào)整濃度后的淋巴細(xì) 胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0按細(xì)胞個(gè)數(shù)比為2 :1混合均勻，離心洗絳細(xì)胞，去除上清液，置 于37°C水浴，加入lmL 37°C預(yù)溫的PEG 1450,再加入25ml 37°C預(yù)溫的MDM無(wú)血清培養(yǎng)基 終止PEG作用；離心，取沉淀；然后在沉淀中加入步驟2-1的飼養(yǎng)細(xì)胞懸液，接種到96孔細(xì) 胞培養(yǎng)板中，置于37°C，5 % 0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0017] 步驟（3).雜交瘤細(xì)胞的篩選
[0018] 3-1?初篩：
[0019] 融合細(xì)胞在5 % C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天后，換用1 X HT的IMDM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)4天 后，觀察96孔細(xì)胞培養(yǎng)板里的融合細(xì)胞生長(zhǎng)情況，在細(xì)胞生長(zhǎng)到細(xì)胞團(tuán)簇（在16倍物鏡和 10倍目鏡下觀察，細(xì)胞大小占滿1/3視野）時(shí)，吸取融合細(xì)胞培養(yǎng)上清液，采用間接ELISA 方法篩選陽(yáng)性克隆。
[0020] 所述的1 X HT的頂DM培養(yǎng)液含有體積分?jǐn)?shù)為15 %的FBS。
[0021] 3-2?復(fù)篩：
[0022] 將篩選到的陽(yáng)性克隆進(jìn)一步用競(jìng)爭(zhēng)抑制ELISA方法進(jìn)行復(fù)篩，篩選出競(jìng)爭(zhēng)抑制率 最高的9G2. 5雜交瘤細(xì)胞株做克隆培養(yǎng)。
[0023] 3-3.雜交瘤細(xì)胞株9G2. 5的克隆化：
[0024] 雜交瘤細(xì)胞株9G2. 5的克隆化培養(yǎng)按有限稀釋法進(jìn)行，準(zhǔn)確計(jì)數(shù)細(xì)胞，用含體積 分?jǐn)?shù)為15 % FBS的頂DM培養(yǎng)基稀釋成4個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，然后以每孔200ul稀釋后的 細(xì)胞懸液接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，7天后觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，并檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)板中細(xì)胞 培養(yǎng)上清液的抗體水平，選擇3個(gè)抗體效價(jià)最高的單克隆，做再次克隆化培養(yǎng)，直至單克隆 孔抗體檢測(cè)陽(yáng)性率達(dá)到100 % ;然后挑取單克隆細(xì)胞，命名為9G2. 5,擴(kuò)大培養(yǎng)后進(jìn)行抗美 沙酮代謝物EDDP單克隆抗體純化。
[0025] 步驟（4).抗美沙酮代謝物EDDP單克隆抗體純化
[0026] 將篩選到的單克隆細(xì)胞株9G2. 5用含體積分?jǐn)?shù)為10 % FBS的MDM培養(yǎng)基接種到 24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，第二天接種到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)1天后，接種到細(xì)胞滾瓶中，滾瓶培 養(yǎng)4天后，收集培養(yǎng)上清液，將培養(yǎng)上清液濃縮后得到含有抗美沙酮代謝物EDDP單克隆抗 體的細(xì)胞培養(yǎng)濃縮液，然后用HiTrap PROTEIN G HP親和柱純化，得到純化后的抗美沙酮代 謝物EDDP單克隆抗體。
[0027] 所述的PBS緩沖液為含有0. 008M十二水磷酸氫二鈉、0. 15M氯化鈉、0. 002M二水 磷酸二氫鈉的水溶液，pH為7. 4 ;
[0028] 所述的1 X HAT的頂DM培養(yǎng)液含有體積分?jǐn)?shù)為15 %的FBS。
[0029] 本發(fā)明最后一個(gè)目的是提供雜交瘤細(xì)胞株9G2. 5分泌的抗美沙酮代謝物EDDP單 克隆抗體在制備檢測(cè)美沙酮代謝物EDDP膠體金試紙條上的應(yīng)用。美沙酮代謝物EDDP膠體 金試紙條產(chǎn)品具有快速，操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。為美沙酮代謝物的檢測(cè)提供了一種有效的現(xiàn)場(chǎng) 尿檢手段。本發(fā)明提供的EDDP雜交瘤細(xì)胞株所分泌的抗體用于膠體金試紙條上的標(biāo)記原 料，尿檢的檢測(cè)閾值在l〇〇ng/ml。
[0030] 本發(fā)明所具有的有益效果：
[0031] 1.本發(fā)明在制備抗美沙酮代謝物EDDP單克隆抗體過(guò)程中，采用小劑量肌肉注射 免疫方法，免疫效價(jià)高。
[0032] 2.雜交瘤細(xì)胞株9G2. 5能夠高效、穩(wěn)定分泌抗美沙酮代謝物EDDP單克隆抗體，并 且該單克隆抗體的效價(jià)高、特異性好、敏感性高，能夠大量生產(chǎn)，可用于制備檢測(cè)美沙酮代 謝物EDDP的酶聯(lián)免疫分析法試劑盒、膠體金試紙條等免疫學(xué)檢測(cè)試劑。
[0033] 3.采用本發(fā)明包含抗美沙酮代謝物EDDP單克隆抗體的膠體金試紙條能快速且靈 敏地檢測(cè)尿液，具有高靈敏度特點(diǎn)，適用于l〇〇ng/ml閾值的檢測(cè)。
【具體實(shí)施方式】
[0034] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的分析（下面實(shí)施例中PBS緩沖液為含有 0. 008M十二水磷酸氫二鈉、0. 15M氯化鈉、0. 002M二水磷酸二氫鈉的水溶液，pH為7. 4 ;后 小腿肌肉部位為小鼠腿部暴露在外部有大塊肌肉的地方，而小鼠的大腿大部分被腹部皮膚 包裹，也可找到膝關(guān)節(jié)區(qū)分小腿大腿；1XHAT的MDM培養(yǎng)液含有體積分?jǐn)?shù)15 %的FBS ; 1 XHT的MDM培養(yǎng)液含有體積分?jǐn)?shù)為15 %的FBS)。
[0035] 本發(fā)明抗美沙酮代謝物EDDP雜交瘤細(xì)胞株命名為雜交瘤細(xì)胞株9G2. 5,于2015年 1月15日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（China Center for Type Culture Collection， 簡(jiǎn)稱CCTCC)，保藏號(hào)為CCTCC N0:C201507 ;保藏地址是中國(guó)武漢武漢大學(xué)。
[0036] 本發(fā)明涉及的雜交瘤細(xì)胞株9G2. 5可分泌一種抗美沙酮代謝物EDDP單克隆抗體。
[0037] 制備本發(fā)明涉及的雜交瘤細(xì)胞株9G2. 5并分泌抗美沙酮代謝物EDDP單克隆抗體 的方法，包括步驟如下：
[0038] 步驟（1).小鼠免疫：
[0039] 取8周齡的BALB/c雌鼠，用美沙酮代謝物EDDP人工抗原注射小鼠后小腿肌肉，每 隔1周注射一次，共注射4次；第一次美沙酮代謝物EDDP人工抗原免疫量為20 y g/只，第 一次美沙酮代謝物EDDP人工抗原免疫量進(jìn)行抗原乳化步驟，抗原乳化步驟是將美沙酮代 謝物EDDP人工抗原免疫量稀釋于20ulPBS緩沖液中，得到稀釋抗原，與等體積量的弗氏完 全佐劑乳化；后續(xù)二次美沙酮代謝物EDDP人工抗原免疫量為20ug/只，抗原乳化步驟與第 一次相同；最后1次美沙