酮代謝物EDDP人工抗原免疫量改為5ug/只，抗原乳化步驟與第一 次相同。
[0040] 步驟（2).淋巴細胞與骨髓瘤細胞的融合：
[0041] 2-1.飼養(yǎng)細胞制備：小鼠摘眼球處死，浸泡于75 %酒精中消毒10min，撕開小鼠腹 外皮膚，暴露其腹膜，用無菌注射器注入8mL 37°C預熱的MDM無血清培養(yǎng)基，輕揉小鼠腹 腔，懸浮腹腔細胞，吸出腹腔液；1500rpm下離心3min，沉淀物用1 XHAT的MDM培養(yǎng)液重 懸，得到飼養(yǎng)細胞懸液。
[0042] 2-2.小鼠骨髓瘤細胞SP2/0的培養(yǎng)：把小鼠骨髓瘤細胞SP2/0用含體積分數(shù)為 10 % FBS的IMDM培養(yǎng)基進行傳代培養(yǎng)，細胞融合前一天進行傳代以保證小鼠骨髓瘤細胞 SP2/0適合生長狀態(tài)良好用于細胞融合。
[0043] 2-3.淋巴細胞制備：取經(jīng)步驟⑵處理的BALB/c雌鼠靠近淋巴結皮下部位的淋 巴結，研磨淋巴細胞至懸液，將淋巴細胞懸液1500rpm下離心5min，取沉淀，然后用MDM培 養(yǎng)基調整研磨后淋巴細胞的濃度至1 X 107個/mL。
[0044] 2-4.淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合：將調整濃度后的淋巴細胞與小鼠骨髓瘤細胞 SP2/0按細胞個數(shù)比為2 :1混合均勻，1500rpm下離心洗滌細胞1次，去除上清液，輕輕彈 擊離心管底，使細胞沉淀松動，置于37°C水浴，在90s內緩緩加入lmL 37°C預溫的lmL PEG 1450,邊加邊輕微搖動；加入25ml 37°C預溫的MDM無血清培養(yǎng)基終止PEG作用；lOOOrpm 下離心5min，取沉淀；然后在沉淀中加入步驟2-1制備的飼養(yǎng)細胞懸液，接種到96孔細胞 培養(yǎng)板中，置于37°C，5 % 0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0045] 步驟（3) ?雜交瘤細胞的融合篩選：
[0046] 3_1?初篩：
[0047] 步驟3-4中融合細胞在5 % C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天后，換用IXHT的IMDM培養(yǎng) 液，繼續(xù)培養(yǎng)4天后，觀察96孔細胞培養(yǎng)板里的融合細胞生長情況，在細胞生長到細胞團簇 (在16倍物鏡和10倍目鏡下觀察，細胞大小以占滿1/3視野為宜）時，吸取融合細胞培養(yǎng)上 清液，采用間接ELISA方法篩選陽性克隆。間接ELISA方法的操作步驟是：①用pH9. 6濃度 為0. 05M的碳酸鹽緩沖液稀釋美沙酮代謝物EDDP人工抗原至lug/mL，96孔酶標板每孔中 分別加入l〇〇ul稀釋后的美沙酮代謝物EDDP人工抗原，4°C包被過夜，用含0. 05 % tween20 的PBS緩沖液洗板3次；②將PBS緩沖液加入到融合細胞培養(yǎng)上清液稀釋至25倍體積，然 后在96孔細胞培養(yǎng)板中每孔加入100 y 1稀釋后的融合細胞培養(yǎng)上清液，同時設立陰性對 照，37°C反應60分鐘后，用含0. 05 % tween20的PBS緩沖液洗板1次；③將PBS緩沖液加 入到羊抗鼠IgG-HRP稀釋到5000倍體積，然后在96孔細胞培養(yǎng)板中每孔加入100 y 1稀釋 后的羊抗鼠IgG-HRP，37°C反應30分鐘后，用含0. 05 % tween20的PBS緩沖液洗板3次； ④每孔加入50ul底物TMB，37°C下反應8分鐘；⑤加入50ul濃度為2M的H 2S04終止反應， 在450nm下測定其0D值，以融合細胞培養(yǎng)上清液0D450值/陰性對照0D450值>2. 5為陽 性克隆，將篩選到的陽性克隆進一步的用競爭抑制ELISA方法進行復篩。
[0048] 3-2?復篩：
[0049] 競爭抑制ELISA方法的操作步驟是：①取50ul濃度為100ng/ml的美沙酮代謝物 EDDP標準品和50ul上述步驟3-1得到的陽性克隆培養(yǎng)上清液混合后，加入到用美沙酮代 謝物EDDP人工抗原包被的酶標孔中，同時設計空白對照，即50ulPBS緩沖液和50ul陽性克 隆培養(yǎng)上清液混合加入到酶標孔中，37°C孵育60分鐘后，用含0. 05 % tween20的PBS緩 沖液洗板1次；②將PBS緩沖液加入到羊抗鼠IgG-HRP稀釋到5000倍體積，然后在96孔 細胞培養(yǎng)板中每孔加入100 U 1稀釋后的羊抗鼠IgG_HRP，37°C下孵育30分鐘，用含0. 05 % tween20的PBS緩沖液洗板3次；③每孔加入50ul底物TMB，37°C下反應8分鐘；④加入 50ul濃度為2M的H2SOj#止反應，在450nm下測定其0D值，挑取競爭抑制率最高的雜交瘤 細胞株9G2. 5做克隆培養(yǎng)。
【主權項】
1. 一種抗美沙酮代謝物EDDP雜交瘤細胞株，其特征在于該抗美沙酮代謝物EDDP雜交 瘤細胞株命名為雜交瘤細胞株9G2. 5,于2015年1月15日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中 心，保藏號為CCTCCN0:C201507。
2. -種由權利要求1所述雜交瘤細胞株分泌的抗美沙酮代謝物EDDP單克隆抗體。
3. 權利要求2所述單克隆抗體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟： 步驟（1).小鼠免疫 取8周齡的BALB/c雌鼠，用美沙酮代謝物EDDP人工抗原注射小鼠后小腿肌肉，每隔1 周注射一次，共注射4次；第一次美沙酮代謝物EDDP人工抗原免疫量為20yg/只，第一次 美沙酮代謝物EDDP人工抗原免疫之前進行抗原乳化步驟，抗原乳化步驟是將美沙酮代謝 物EDDP人工抗原免疫量稀釋于20ulPBS緩沖液中，得到稀釋抗原，與等體積量的弗氏完全 佐劑乳化；后續(xù)二次美沙酮代謝物EDDP人工抗原免疫量為20ug/只，抗原乳化步驟與第一 次相同；最后1次美沙酮代謝物EDDP人工抗原免疫量改為5ug/只，抗原乳化步驟與第一次 相同； 步驟（2).淋巴細胞與骨髓瘤細胞的融合 2-1.飼養(yǎng)細胞制備：小鼠摘眼球處死，浸泡于75 %酒精中消毒，撕開小鼠腹外皮膚， 暴露其腹膜，注入37°C預熱的IMDM無血清培養(yǎng)基，輕揉小鼠腹腔，懸浮腹腔細胞，吸出腹腔 液；離心，沉淀物用IXHAT的IMDM培養(yǎng)液重懸，得到飼養(yǎng)細胞懸液； 2-2.小鼠骨髓瘤細胞SP2/0的培養(yǎng)：把小鼠骨髓瘤細胞SP2/0用含體積分數(shù)為10 %FBS的頂DM培養(yǎng)基進行傳代培養(yǎng)，細胞融合前一天進行傳代以保證小鼠骨髓瘤細胞SP2/0 適合生長狀態(tài)良好用于細胞融合； 2-3.淋巴細胞制備：取經(jīng)步驟（2)處理的BALB/c雌鼠靠近淋巴結皮下部位的淋巴結， 研磨淋巴細胞至懸液；淋巴細胞懸液離心，取沉淀；在沉淀中加入MDM培養(yǎng)基，調整淋巴細 胞的濃度至IXIO7個/mL; 2- 4.淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合：采用聚乙二醇融合法；將調整濃度后的淋巴細胞與 小鼠骨髓瘤細胞SP2/0按細胞個數(shù)比為2 :1混合均勻，離心洗絳細胞，去除上清液，置于 37°C水浴，加入ImL37°C預溫的PEG1450,再加入25ml37°C預溫的MDM無血清培養(yǎng)基終 止PEG作用；離心，取沉淀；然后在沉淀中加入步驟2-1的飼養(yǎng)細胞懸液，接種到96孔細胞 培養(yǎng)板中，置于37°C，5 % 0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)； 步驟（3).雜交瘤細胞的篩選 3- 1.初篩： 融合細胞在5 %CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天后，換用IXHT的IMDM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)4天后， 觀察96孔細胞培養(yǎng)板里的融合細胞生長情況，在細胞生長到細胞團簇（在16倍物鏡和10 倍目鏡下觀察，細胞大小占滿1/3視野）時，吸取融合細胞培養(yǎng)上清液，采用間接ELISA方 法篩選陽性克??；所述的IXHT的頂DM培養(yǎng)液含有體積分數(shù)為15 %的FBS; 3-2.復篩： 將篩選到的陽性克隆進一步用競爭抑制ELISA方法進行復篩，篩選出競爭抑制率最高 的9G2. 5雜交瘤細胞株做克隆培養(yǎng)； 3-3.雜交瘤細胞株9G2. 5的克隆化： 雜交瘤細胞株9G2. 5的克隆化培養(yǎng)按有限稀釋法進行，準確計數(shù)細胞，用含體積分數(shù) 為15 %FBS的頂DM培養(yǎng)基稀釋成4個/mL的細胞懸液，然后以每孔200ul稀釋后的細胞 懸液接種到96孔細胞培養(yǎng)板中，7天后觀察細胞生長情況，并檢測細胞培養(yǎng)板中細胞培養(yǎng) 上清液的抗體水平，選擇3個抗體效價最高的單克隆，做再次克隆化培養(yǎng)，直至單克隆孔抗 體檢測陽性率達到100 % ;然后挑取單克隆細胞，命名為9G2. 5,擴大培養(yǎng)后進行抗美沙酮 代謝物EDDP單克隆抗體純化； 步驟（4).抗美沙酮代謝物EDDP單克隆抗體純化 將篩選到的單克隆細胞株9G2. 5用含體積分數(shù)為10 %FBS的MDM培養(yǎng)基接種到24 孔細胞培養(yǎng)板中，第二天接種到細胞培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)1天后，接種到細胞滾瓶中，滾瓶培養(yǎng)4 天后，收集培養(yǎng)上清液，將培養(yǎng)上清液濃縮后得到含有抗美沙酮代謝物EDDP單克隆抗體的 細胞培養(yǎng)濃縮液，然后用HiTrapPROTEINGHP親和柱純化，得到純化后的抗美沙酮代謝物 EDDP單克隆抗體。
4.權利要求2所述抗美沙酮代謝物EDDP單克隆抗體在制備檢測美沙酮代謝物EDDP膠 體金試紙條上的應用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種抗美沙酮代謝物EDDP雜交瘤細胞株，其特征在于該抗美沙酮代謝物EDDP雜交瘤細胞株命名為雜交瘤細胞株9G2.5，于2015年1月15日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC NO:C201507。該雜交瘤細胞株能夠產生高特異性的抗美沙酮代謝物EDDP單克隆抗體，生產效率高。分泌的抗美沙酮代謝物EDDP單克隆抗體具有較高的特異性、敏感性，交叉反應率低，可用于制備檢測美沙酮代謝物EDDP膠體金試紙條。CCTCC NO:C20150720150115
【IPC分類】G01N33-577, C12R1-91, C07K16-44, C12N5-20
【公開號】CN104789535
【申請?zhí)枴緾N201510208740
【發(fā)明人】蘇娟, 高飛, 陳東
【申請人】杭州奧泰生物技術有限公司
【公開日】2015年7月22日
【申請日】2015年4月28日