源自于薰衣草的 0 _水芹烯合成酶基因的重組大腸桿菌，培養(yǎng)該重組大腸桿菌生產(chǎn)0 _水芹烯。
[0125] (1)源自于擬南芥的GPP合成酶基因的分離
[0126] 以源自于擬南芥（Arabidopsisthaliana)的總RNA為模板，通過使用了序列號13 和序列號14所示引物的RT-PCR對編碼源自于擬南芥的GPP合成酶的核酸（源自于擬南芥 的GPP合成酶基因、序列號1、基因銀行注冊編號（GenBankAccessionNo.) :Y17376)進(jìn)行 擴增。將所得到的核酸用Ndel及EcoRI切割后，導(dǎo)入至pET23a載體（Novagen株式會社）。 確認(rèn)載體中所導(dǎo)入的核酸的堿基序列，確認(rèn)到?jīng)]有差異。由此，制作源自于擬南芥的GPP合 成酶表達(dá)載體PT23AGPP。
[0127] (2)源自于薰衣草的水芹烯合成酶基因的分離
[0128] 以源自于薰衣草（Lavandulaangustifolia)的總RNA為模板，通過使用了序列號 15和序列號16所示引物的RT-PCR對編碼源自于薰衣草的水芹烯合成酶的核酸（源 自于薰衣草的水芹烯合成酶基因、序列號7、基因銀行注冊編號（GenBankAccession No.) :HQ404305)進(jìn)行擴增。將所得到的核酸用Ncol及EcoRI切割后，導(dǎo)入至pACYCDuet-1 載體（Novagen株式會社）。確認(rèn)載體中所導(dǎo)入的核酸的堿基序列，確認(rèn)到?jīng)]有差異。由此， 制作源自于薰衣草的0-水芹烯合成酶表達(dá)載體pACLPD。
[0129] (3)具有0-水芹烯生產(chǎn)能力的重組大腸桿菌的制作
[0130] 將上述（1)、⑵中所得到的表達(dá)載體PT23AGPP及pACLPD導(dǎo)入大腸桿菌 BL21(DE3)株，制作具有0-水芹烯生產(chǎn)能力的重組大腸桿菌BL21BPD2。
[0131] 作為對照，另行制作僅導(dǎo)入了未插有核酸的pET23a載體的重組大腸桿菌以及僅 導(dǎo)入了未插有核酸的pACY⑶uet-1載體的重組大腸桿菌。
[0132] (4)0-水芹烯生產(chǎn)
[0133] 將重組大腸桿菌BL21BPD2在含有氨芐青霉素100yg/mL及氯霉素34yg/mL的 2XYT培養(yǎng)基中，在30°C、110rpm(旋轉(zhuǎn)）的條件下培養(yǎng)30小時。此時，自培養(yǎng)開始16小時 后設(shè)為密閉體系。培養(yǎng)結(jié)束后，通過離心分離得到菌體和培養(yǎng)上清。
[0134] 破碎菌體，用戊烷萃取破碎液的上清。將該萃取分率用氣相色譜進(jìn)行分析，結(jié)果， 檢測到0-水芹烯。
[0135] 關(guān)于培養(yǎng)上清也用戊烷萃取。將該萃取分率用氣相色譜進(jìn)行分析，結(jié)果，檢測到 水芹烯。另外，分析氣相分率，結(jié)果，在氣相中也檢測到水芹烯。
[0136] 另一方面，在僅導(dǎo)入了pET23a載體或者pACY⑶uet-1載體的對照的重組大腸桿菌 中，菌體、培養(yǎng)上清及氣相中均未檢測到水芹烯。
[0137] 由以上顯示，可通過培養(yǎng)導(dǎo)入了源自于擬南芥的GPP合成酶基因和源自于薰衣草 的水芹烯合成酶基因的重組大腸桿菌，來生產(chǎn)水芹烯。另外，所生產(chǎn)的水芹烯 可從菌體、培養(yǎng)上清及氣相中回收。
[0138] 實施例3
[0139] 在本實施中，制作導(dǎo)入了源自于西紅柿的NPP合成酶基因和源自于西紅柿的 0 _水芹烯合成酶基因的重組酵母，培養(yǎng)該重組酵母生產(chǎn)0 _水芹烯。
[0140] (1)源自于西紅柿的NPP合成酶基因的分離
[0141] 以源自于西紅柿的的總RNA為模板，通過使用了序列號13和序列號14所示的引 物的RT-PCR，對編碼源自于西紅柿的NPP合成酶的核酸（源自于西紅柿的NPP合成酶基 因、序列號3、基因銀行注冊編號（GenBankAccessionNo.) :FJ797956)進(jìn)行擴增。將所得 到的核酸用BamHI切割后，導(dǎo)入至pPIC3. 5K載體（Invitrogen株式會社）。確認(rèn)載體中所 導(dǎo)入的核酸的堿基序列，確認(rèn)到?jīng)]有差異。由此，制作源自于西紅柿的NPP合成酶表達(dá)載體 pP3. 5TNPP。
[0142] (2)源自于西紅柿的水芹烯合成酶基因的分離
[0143] 以源自于西紅柿的的總RNA為模板，通過使用了序列號19和序列號20所示引物 的RT-PCR，對編碼源自于西紅柿的水芹烯合成酶的核酸（源自于西紅柿的水芹烯 合成酶基因、序列號5、基因銀行注冊編號（GenBankAccessionNo.) :FJ797957)進(jìn)行擴增。 將所得到的核酸用BamHI切割后，導(dǎo)入至pPIC3. 5K載體（Invitrogen株式會社）。確認(rèn)載 體中所導(dǎo)入的核酸的堿基序列，確認(rèn)到?jīng)]有差異。由此，制作源自于西紅柿的水芹烯合 成酶表達(dá)載體PP3.5TH)。
[0144] (3)具有水芹烯生產(chǎn)能力的重組酵母的制作
[0145] 對甲醇利用性酵母畢赤酵母（Pichiapastoris)GS115株（Invitrogen株式會社） 利用上述（1)、（2)中所得到的表達(dá)載體pP3. 5TNPP及pP3. 5TH)的等量混合物進(jìn)行轉(zhuǎn)化。 轉(zhuǎn)化的方法按照Invitrogen株式會社的手冊（No. 25-0156、No. 25-0043)進(jìn)行。為了得到 多拷貝的基因?qū)塍w，獲得1. 5mg/mL濃度的遺傳霉素（Geneticin) (Invitrogen株式會社） 抗性株。由此，獲得重組酵母GSNP-1，其具有各自多個復(fù)制的源自于西紅柿的NPP合成酶基 因及源自于西紅柿的水芹烯合成酶基因。
[0146] 作為對照，獲得僅導(dǎo)入了未插有核酸的pPIC3. 5K載體的、濃度為1. 5mg/mL的遺傳 霉素（Geneticin) (Invitrogen株式會社）抗性株（重組酵母GS115)。
[0147] (4)0-水芹烯生產(chǎn)
[0148]將GSNP-1 在MGY培養(yǎng)基（1. 34% (w/v)YNB, 1% (w/v)甘油（glycerol)，4Xl〇-5% (w/v)生物素（biotin) ;YMB:13.4% (w/v)酵母氮源（yeastnitrogenbase), 10% (w/ v)硫酸按（ammoniumsulfate)) (Invitrogen株式會社手冊No. 25-0043)中進(jìn)行預(yù)培養(yǎng) 后，回收菌體，將回收菌體在發(fā)酵基礎(chǔ)鹽（Fermentationbasalsalts)培養(yǎng)基（85%磷酸 26.7ml,硫酸媽 0.093 % (w/v),硫酸鉀 1.82 % (w/v),硫酸鎂-7H20 1.49% (w/v),氫氧 化鉀 0.413 % (w/v),甘油 4.0 % (w/v))(Invitrogen株式會社手冊Ver.B053002)中主培 養(yǎng)64小時。此時，自培養(yǎng)開始24小時后制成密閉體系。為了誘導(dǎo)導(dǎo)入的酶基因進(jìn)行表達(dá)， 在自培養(yǎng)開始經(jīng)過24小時時和經(jīng)過48小時時，在培養(yǎng)液中添加1/200容積的100%甲醇。 培養(yǎng)結(jié)束后，通過離心分離回收菌體及培養(yǎng)上清。
[0149] 通過玻璃珠法（Invitrogen株式會社手冊No. 25-0043)使菌體破碎，得到上清。將 該上清的戊烷萃取物用氣相色譜分析，結(jié)果，檢測到0 _水芹烯。
[0150] 關(guān)于培養(yǎng)上清也用戊烷萃取。將該萃取分率用氣相色譜進(jìn)行分析，結(jié)果，檢測到 水芹烯。另外，分析氣相分率，結(jié)果，在氣相中也檢測到水芹烯。
[0151] 另一方面，在僅導(dǎo)入了pPIC3. 5K載體的對照的重組酵母GS115中，菌體、培養(yǎng)上清 及氣相中均未檢測到水芹烯。
[0152] 由以上顯示，可通過培養(yǎng)導(dǎo)入了源自于西紅柿的NPP合成酶基因和源自于西紅柿 的水芹烯合成酶基因的重組酵母，來生產(chǎn)水芹烯。另外，所生產(chǎn)的水芹烯可從 菌體、培養(yǎng)上清及氣相中回收。
[0153] 實施例4
[0154] 在本實施中，制作導(dǎo)入了源自于擬南芥的GPP合成酶基因和源自于薰衣草的 0 _水芹烯合成酶基因的重組酵母，培養(yǎng)該重組酵母生產(chǎn)0 _水芹烯。
[0155] (1)源自于擬南芥的GPP合成酶基因的分離
[0156] 以源自于擬南芥的的總RNA為模板，通過使用了序列號21和序列號22所示引物 的RT-PCR對編碼源自于擬南芥的GPP合成酶的核酸（源自于擬南芥的GPP合成酶基因、序 列號1、基因銀行注冊編號（GenBankAccessionNo.) :Y17376)進(jìn)行擴增。將所得到的核酸 用BamHI切割后，導(dǎo)入至pPIC3. 5K載體（Invitrogen株式會社）。確認(rèn)載體中所導(dǎo)入的核酸 的堿基序列，確認(rèn)到?jīng)]有差異。由此，制作源自于擬南芥的GPP合成酶表達(dá)載體pP3. 5AGPP。
[0157] (2)源自于薰衣草的水芹烯合成酶基因的分離
[0158] 以源自于薰衣草的的總RNA為模板，通過使用了序列號23和序列號24所示引物 的RT-PCR對編碼源自于薰衣草的0-水芹烯合成酶的核酸（源自于薰衣草的0-水芹烯 合成酶基因、序列號7、基因銀行注冊編號（GenBankAccessionNo.) :HQ404305)進(jìn)行擴增。 將所得到的核酸用EcoRI切割后，導(dǎo)入至pPIC3. 5K載體（Invitrogen株式會社）。確認(rèn)載 體中所導(dǎo)入的核酸的堿基序列，確認(rèn)到?jīng)]有差異。由此，制作源自于薰衣草的水芹烯合 成酶表達(dá)載體pP3. 5LPD。
[0159] (3)具有水芹烯生產(chǎn)能力的重組酵母的制作
[0160] 對甲醇利用性酵母畢赤酵母（Pichiapastoris)GS115株（Invitrogen株式會社） 用上述（1)、（2)中所得到的表達(dá)載體pP3. 5AGPP及pP3. 5LH)的等量混合物進(jìn)行轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn) 化的方法按照Invitrogen株式會社的手冊（No. 25-0156、No. 25-0043)進(jìn)行。為了得到多 拷貝的基因?qū)塍w，獲得濃度為1. 5mg/mL的遺傳霉素（Geneticin) (Invitrogen株式會社） 抗性株。由此，獲得重組酵母GSNP-2,其具有各自多個復(fù)制的源自于擬南芥