的GPP合成酶基 因及源自于薰衣草的水芹烯合成酶基因。
[0161] (4)0-水芹烯生產
[0162] 將GSNP-2在MGY培養(yǎng)基（Invitrogen株式會社手冊No. 25-0043)中進行預培養(yǎng) 后，回收菌體，將回收菌體在發(fā)酵基礎鹽（Fermentationbasalsalts)培養(yǎng)基（Invitrogen 株式會社手冊Ver.B053002)中主培養(yǎng)64小時。為了誘導導入的酶基因進行表達，在自培 養(yǎng)開始經過24小時時和經過48小時時，在培養(yǎng)液中添加1/200容積的100%甲醇。此時， 自培養(yǎng)開始24小時后制成密閉體系。培養(yǎng)結束后，通過離心分離回收菌體及培養(yǎng)上清。
[0163] 通過玻璃珠法（Invitrogen株式會社手冊No. 25-0043)使菌體破碎，得到上清。將 該上清的戊烷萃取物用氣相色譜分析，結果，檢測到0 _水芹烯。
[0164] 關于培養(yǎng)上清也用戊烷萃取。將該萃取分率用氣相色譜進行分析，結果，檢測到 水芹烯。另外，分析氣相分率，結果，在氣相中也檢測到水芹烯。
[0165] 另一方面，在僅導入了pPIC3. 5K載體的對照的重組酵母GS115(實施例3中制作） 中，菌體、培養(yǎng)上清及氣相中均未檢測到水芹烯。
[0166] 由以上顯示，可通過培養(yǎng)導入了源自于擬南芥的GPP合成酶基因和源自于薰衣草 的水芹烯合成酶基因的重組酵母，來生產水芹烯。另外，所生產的水芹烯可從 菌體、培養(yǎng)上清及氣相中回收。
[0167] 實施例5
[0168] 在本實施中，制作導入了源自于西紅柿的NPP合成酶基因和源自于薰衣草的 0 _水芹烯合成酶基因的重組大腸桿菌，培養(yǎng)該重組大腸桿菌，并進行水芹烯的產生確認和 副產物的鑒定。
[0169] 將實施例2中制作的pACLPD用NC0I及EcoRI切割，切下源自于薰衣草的水芹 稀合成酶基因，導入至pCOLADuet-1 (Novagen株式會社）的Ncol及EcoRI切割部位，構建 pCODLFS。另一方面，以實施例1中制作的pT21TNPP為模板使用序列號25及26的引物進行 PCR，對源自于西紅柿的NPP合成酶基因進行擴增。將擴增的片段用Ndel及Kpnl切割，導 入上述pCODLFS的Ndel及Kpnl切割部位，構建共表達載體pCOLDFSNS。將上述pCOLDFSNS 導入至Rosetta2 (DE3)，得到對源自于薰衣草的0 -水芹烯合成酶及源自于西紅柿的NPP合 成酶進行共表達的重組大腸桿菌R0FSNS。作為對照大腸桿菌，制作僅具有pCOLADuet-1的 重組大腸桿菌R0C0LA。
[0170] 將重組大腸桿菌R0FSNS及R0C0LA在含有氯霉素34yg/mL及卡那霉素15yg/ mL的2XYT培養(yǎng)基（1.6% (w/v)細菌用蛋白胨（BactoTription)，l% (w/v)酵母抽提物 (YeastExtract)，0.5% (w/v)NaCl)中，在18°C、110rpm(旋轉）的條件下以密閉體系培養(yǎng) 24小時。培養(yǎng)結束后，通過GC-MS分析氣相分率。如圖1所示，在R0FSNS中，檢測到水 芹烯（峰A)，也檢測到認為是副產物的峰B及C。另一方面，在R0C0LA中，未檢測到這些峰。 另外，進行各峰的鑒定，結果，如圖2所示，在R0FSNS的培養(yǎng)氣相中，除主要生成物即0 -水 芹烯以外，也生成少量的作為副產物的檸檬烯（峰B)及月桂烯（峰C)。
[0171] 利用R0FSNS的0 -水芹烯在氣相中的生成量為750yg/L培養(yǎng)液。
[0172] 實施例6
[0173] 在本實施中，制作導入了源自于放線菌的甲羥戊酸路徑基因、源自于西紅柿的NPP 合成酶基因及源自于薰衣草的0 _水芹烯合成酶基因的重組大腸桿菌，培養(yǎng)該重組大腸桿 菌生產水芹烯。
[0174] 以灰色抱鏈霉菌（Streptomycesgriseolosporeus)(Kitasatosporagriseola) 的基因組DNA為模板，通過使用了序列號27和序列號28所示引物的PCR對編碼灰色孢鏈霉 (S.griseolosporeus)的甲羥戊酸路徑酶的核酸（序列號29)進行擴增。在該核酸中含有編 碼甲羥戊酸激酶、甲羥戊酸二磷酸脫羧酶、甲羥戊酸磷酸激酶、IPP異構酶、HMG-CoA(3-羥 基-3-甲基戊二酰輔酶A)還原酶（HMGR)及HMG-CoA合成酶的基因簇。向pT7-BlueT載 體克隆所得到的擴增DNA片段，構建pT7SMV。
[0175] 對由上述載體pT7SMV用Ncol及EcoRI切割而回收得到的基因片段導入至pCOLA Duet-1(Novagen株式會社）的Ncol及EcoRI切割位點，構建pCSMV。
[0176] 向pCSMV的Ndel-Kpnl切割部位導入序列號30所示的西紅柿NPP合成酶基因、薰 衣草水芹烯合成酶基因操縱子的合成核酸，構建含有放線菌甲羥戊酸路徑基因、西紅 柿NPP合成酶基因及薰衣草水芹烯合成酶基因的pCSMVNSFS。將表達載體pCSMVNSFS 導入至大腸桿菌R〇setta2 (DE3)，得到重組大腸桿菌ROSMVNSFS。
[0177] 將重組大腸桿菌ROSMVNSFS在含有氯霉素34yg/mL及卡那霉素15yg/mL的 2XYT培養(yǎng)基（1.6%(w/v)細菌用蛋白胨，1%(w/v)酵母抽提物，0.5%(w/v)NaCl)中， 在18°C、110rpm(旋轉）的條件下以密閉體系培養(yǎng)24小時。培養(yǎng)結束后，通過氣相色譜分 析氣相分率，結果，檢測到0 -水芹烯。0 -水芹烯在氣相中的生成量為8. 5mg/L培養(yǎng)液。
[0178] 從以上的結果和實施例5中的水芹烯生成量考慮，可通過進一步導入放線菌 MVA路徑基因來增大水芹烯的產生量。
【主權項】
1. 一種具有0 -水芹烯生產能力的重組細胞，其將選自編碼櫳牛兒基二磷酸合成酶的 核酸及編碼橙花基二磷酸合成酶的核酸中的至少1種核酸和編碼e-水芹烯合成酶的核酸 導入宿主細胞而成，且這些核酸在宿主細胞內表達。
2. 如權利要求1所述的重組細胞，其中，宿主細胞不具有甲烷單加氧酶。
3. 如權利要求2所述的重組細胞，其中，宿主細胞為大腸桿菌或酵母。
4. 如權利要求1~3中任一項所述的重組細胞，其中，重組細胞的濕潤菌體Ig能夠生 產IOmg以上的0-水芹烯。
5. 如權利要求1~4中任一項所述的重組細胞，其中，編碼櫳牛兒基二磷酸合成酶的核 酸對下述（a)、（b)或（c)的蛋白質進行編碼， (a) 由序列號2所示的氨基酸序列構成的蛋白質、 (b) 由在序列號2所示的氨基酸序列中缺失、置換或添加了 1~20個氨基酸而成的氨 基酸序列構成，且具有櫳牛兒基二磷酸合成酶活性的蛋白質、 (c) 具有與序列號2所示的氨基酸序列顯示60%以上的同源性的氨基酸序列，且具有 櫳牛兒基二磷酸合成酶活性的蛋白質。
6. 如權利要求1~5中任一項所述的重組細胞，其中，編碼橙花基二磷酸合成酶的核酸 對下述（d)、（e)或（f)的蛋白質進行編碼， (d) 由序列號4所示的氨基酸序列構成的蛋白質、 (e) 由在序列號4所示的氨基酸序列中缺失、置換或添加了 1~20個氨基酸而成的氨 基酸序列構成，且具有橙花基二磷酸合成酶活性的蛋白質、 (f) 具有與序列號4所示的氨基酸序列顯示60%以上的同源性的氨基酸序列，且具有 橙花基二磷酸合成酶活性的蛋白質。
7. 如權利要求1~6中任一項所述的重組細胞，其中，編碼0 -水芹烯合成酶的核酸對 下述（g)、（h)或⑴的蛋白質進行編碼， (g) 由序列號6或8所示的氨基酸序列構成的蛋白質、 (h) 由在序列號6或8所示的氨基酸序列中缺失、置換或添加有1~20個氨基酸而成 的氨基酸序列構成，且具有0-水芹烯合成酶活性的蛋白質、 (i) 具有與序列號6或8所示的氨基酸序列顯示60%以上的同源性的氨基酸序列，且 具有水芹烯合成酶活性的蛋白質。
8. 如權利要求1~7中任一項所述的重組細胞，其還導入對在異戊烯基二磷酸的合成 路徑中發(fā)揮作用的至少1個酶進行編碼的核酸，該核酸在宿主細胞內表達。
9. 如權利要求8所述的重組細胞，其中，異戊烯基二磷酸的合成路徑為甲羥戊酸路徑。
10. 如權利要求9所述的重組細胞，其中，所述甲羥戊酸路徑為酵母或放線菌的甲羥戊 酸路徑。
11. 一種0 -水芹烯的生產方法，其包括：通過培養(yǎng)權利要求1~10中任一項所述的 重組細胞來使該重組細胞生產0-水序稀。
12. 如權利要求11所述的0 -水芹烯的生產方法，其包括：使重組細胞的濕潤菌體Ig 生產IOmg以上的0 -水芹烯。
13. 如權利要求11或12所述的0 -水芹烯的生產方法，其包括：對釋放到重組細胞的 細胞外的水芹烯進行回收。
【專利摘要】本發(fā)明要解決的問題在于，提供一種用于高純度且大量地獲得β-水芹烯的一系列的技術。提供一種具有β-水芹烯生產能力的重組細胞，其將選自編碼牻牛兒基二磷酸(GPP)合成酶的核酸及編碼橙花基二磷酸(NPP)合成酶的核酸構中的至少1種核酸和編碼β-水芹烯合成酶的核酸導入宿主細胞而成，且這些核酸在宿主細胞內表達。提供一種β-水芹烯的生產方法，其通過培養(yǎng)該重組細胞來使該重組細胞生產β-水芹烯。
【IPC分類】C12N1-19, C12N9-00, C12N15-09, C12P5-00, C12N1-21
【公開號】CN104797704
【申請?zhí)枴緾N201380060882
【發(fā)明人】古谷昌弘, 上西章太, 巖佐航一郎, 郡悌之, 高橋征司, 下山武文
【申請人】積水化學工業(yè)株式會社, 國立大學法人 東北大學
【公開日】2015年7月22日
【申請日】2013年9月19日
【公告號】EP2899263A1, US20150218589, WO2014046174A1