高感染滴度的細(xì)小病毒的生產(chǎn)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及在培養(yǎng)上清中生產(chǎn)高感染滴度的細(xì)小病毒的方法以及通過該方法得 到的高感染滴度的細(xì)小病毒溶液。
【背景技術(shù)】
[0002] 病毒在包括人在內(nèi)的眾多動植物、微生物中感染并擴增。某些病毒是具有DNA作 為基因組的DNA病毒，另外某些病毒是具有RNA作為基因組的RNA病毒，各病毒分別具有不 同的增殖機理。人等動物感染時，引起病毒感染癥的病毒也很多。病毒不能單獨增加，卻能 夠感染其他的動物?植物?微生物的細(xì)胞，利用該細(xì)胞的能力而增加。將病毒能夠感染并 增殖的細(xì)胞稱為該病毒的"宿主細(xì)胞"。病毒能夠感染·增殖的宿主細(xì)胞的種類根據(jù)病毒的 種類而決定。
[0003] 細(xì)小病毒為小型的單鏈DNA病毒，為直徑小至約20nm的正20面體病毒，且不具有 被膜（非專利文獻1)。細(xì)小病毒感染動物而引起疾病。作為該疾病，已知有：B19細(xì)小病 毒對人引起的傳染性紅斑、貧血、關(guān)節(jié)炎，除此之外還有由猴細(xì)小病毒（SPV)導(dǎo)致的貧血、 由貓細(xì)小病毒（FPV)導(dǎo)致的貓的腸炎?白血球減少?失調(diào)癥、由犬細(xì)小病毒（CPV)導(dǎo)致的 犬的腸炎?心肌炎、由豬細(xì)小病毒（PPV)導(dǎo)致豬的死胎、由牛細(xì)小病毒（BPV)導(dǎo)致的牛的腸 炎、由鵝細(xì)小病毒（GPV)導(dǎo)致的鵝的腸炎·心肌炎、由小鼠微小病毒（MVM)導(dǎo)致的小鼠的腸 炎·肝炎等（非專利文獻2、非專利文獻3)。細(xì)小病毒作為引起犬、貓這樣的人類飼養(yǎng)的動 物的生病的原因的病原體，是重要的。已知，如果犬感染犬細(xì)小病毒，則如前述那樣引起腸 炎，產(chǎn)生激烈的痢疾、嘔吐，甚至死亡（非專利文獻3)。如果貓感染了細(xì)小病毒，則有時會 引起急性腸炎、白血球減少，在二次感染時也會有死亡的可能性；另外，如果胎兒、新生兒感 染，則中樞神經(jīng)、胸腺受到損害，引起運動失調(diào)，有時也會死亡。
[0004] 為了防止細(xì)小病毒感染癥，關(guān)于細(xì)小病毒的疫苗進行了研宄（專利文獻1、專利文 獻2)。這些研宄中，需要生產(chǎn)病毒而使用。多數(shù)的病毒可以通過培養(yǎng)宿主細(xì)胞，使其感染病 毒而增殖，從而進行生產(chǎn)。使病毒弱毒化或非活化的疫苗生產(chǎn)也按照與病毒生產(chǎn)同樣的步 驟而實現(xiàn)。
[0005] 在制藥行業(yè)中，為了保證基因重組藥品（生物藥品）、抗體藥品等來源于生物的藥 品不被病毒污染（病毒安全性），需要對于制造工序的病毒清除（去除性能）進行評價。 因此，通過向各工序前的藥品中間產(chǎn)品中添加病毒并且對工序前后的病毒量進行定量，從 而能夠?qū)Ω鱾€工序所具有的病毒清除進行測定。特別是，對于生物制劑的制造工序的病毒 清除評價中所使用的病毒種類的選擇方法，用規(guī)定的ICHdnternational Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use :日美EU醫(yī)藥品法規(guī)協(xié)調(diào)國際會議）指導(dǎo)方針?biāo)涊d的方法實施的血漿分級制 劑的病毒清除評價中，細(xì)小病毒的一種豬細(xì)小病毒（PPV:Porcine Parvovirus)被高頻地 使用，生物藥品的病毒清除評價中，細(xì)小病毒的一種小鼠微小病毒（MVM !Minute virus of mice)被高頻地使用。這樣，在生物制劑的制造工序的病毒清除評價中，高頻地使用細(xì)小病 毒。
[0006] 為了生產(chǎn)病毒，有：使用實驗動物的方法、使用雞蛋的方法、使用組織培養(yǎng)?培養(yǎng) 細(xì)胞的方法（非專利文獻4)。使用實驗動物、雞蛋的方法存在成本高的缺點。代替其的方 法有使用培養(yǎng)細(xì)胞的方法（非專利文獻5)。細(xì)小病毒的生產(chǎn)也通過使用培養(yǎng)細(xì)胞的方法進 行（專利文獻1)。
[0007] 為了生產(chǎn)細(xì)小病毒等病毒，通常進行使宿主細(xì)胞的培養(yǎng)體系感染種病毒，使病毒 增殖而進行回收的方法。此處所說的種病毒是指將病毒增殖初始所使用的少量的病毒視為 "種"的稱呼?，F(xiàn)有的病毒生產(chǎn)中，使宿主細(xì)胞感染種病毒的時機通常是宿主細(xì)胞達到匯合 且形成為單層狀態(tài)的階段（非專利文獻4、專利文獻3~6)。即，通常在將宿主細(xì)胞接種至 培養(yǎng)容器，使之增殖，從而在培養(yǎng)容器底面的整面宿主細(xì)胞增殖并鋪滿的狀態(tài)下接種種病 毒，這是因為能夠感染的細(xì)胞高密度地存在的狀況，是提供生產(chǎn)更多病毒的場所的體系。從 將宿主細(xì)胞接種至培養(yǎng)容器起至其到達該匯合的狀態(tài)為止，通常需要2~3天（非專利文 獻4)。該匯合狀態(tài)下，宿主細(xì)胞為穩(wěn)定期，不再增殖。因此，現(xiàn)有技術(shù)在完成宿主細(xì)胞的增 殖培養(yǎng)工序之后，在不再引起細(xì)胞增殖的培養(yǎng)環(huán)境下開始病毒感染，與宿主細(xì)胞由于病毒 感染而死亡同時進行從而在培養(yǎng)上清中生產(chǎn)病毒。這樣的方法中，用使細(xì)小病毒沒有例外 地感染匯合狀態(tài)的細(xì)胞的方法進行病毒生產(chǎn)（非專利文獻6,非專利文獻7)，得到的細(xì)小病 毒的感染滴度為IO 5~10 7TCID5(l/mL。在現(xiàn)有的培養(yǎng)體系中，在細(xì)胞數(shù)最多的狀態(tài)即匯合的 狀態(tài)下，向宿主細(xì)胞中添加細(xì)小病毒，添加的細(xì)小病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)增殖并伴隨著宿主細(xì) 胞的死亡而增加。通過在細(xì)小病毒感染滴度變得最高的時期對培養(yǎng)上清進行回收，能夠?qū)?最高感染滴度的細(xì)小病毒溶液進行回收。用該方法在培養(yǎng)上清中得到的細(xì)小病毒，當(dāng)然以 懸浮在供于細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基中的狀態(tài)被回收。
[0008] 另外，對于如上述得到的細(xì)小病毒溶液，也進行去除雜質(zhì)。作為去除方法，通過低 速離心分離從而去除細(xì)胞的碎片等雜質(zhì)而進行。另外，作為進一步去除雜質(zhì)的方法，還已知 有使用了超離心分離技術(shù)的、氯化銫密度梯度超離心分離、蔗糖密度梯度超離心分離技術(shù) (非專利文獻8)。
[0009] 現(xiàn)有技術(shù)文獻
[0010] 專利文獻
[0011] 專利文獻I :W02007/125605號公報
[0012] 專利文獻2 :日本特表平10-508485號公報
[0013] 專利文獻3 :日本特開2009-297036號公報
[0014] 專利文獻4 :日本專利第2655876號公報
[0015] 專利文獻5 :日本特開昭58-22008號公報
[0016] 專利文獻6 :日本特開昭61-24370號公報
[0017] 非專利文獻
[0018] 非專利文獻1 :病毒?細(xì)菌感染新文件1997永井美之?渡邊治雄編、羊土社： P. 68 少只?細(xì)菌感染new 7 7 <少1997永井美之?渡邊治雄編、羊土社：P. 68)
[0019] 非專利文獻2:病毒學(xué)1997畑中正一編、朝倉書店：222-223(少只學(xué)1997畑 中正一編、朝倉書店：222-223)
[0020] 非專利文獻 3:M. Azetaka et.al 1980Jpn.J. Vet. Sci. 43:243-255
[0021] 非專利文獻4:病毒實驗學(xué)總論國立預(yù)防衛(wèi)生研宄所學(xué)友會編1973 :61-180(夕彳 少只実験學(xué)総論國立予防衛(wèi)生研宄所學(xué)友會編1973 :61-180)
[0022] 非專利文獻 5:Gregersen, J. P. Pharmazeutische Biotechnologie, Kayser 和 Muller(編）2000257-281
[0023] 非專利文獻 6 :P. A. Bachmann 1972Proc. Soc. Exp. Biol. Med. (140) 4:1369-1374
[0024] 非專利文獻 7:Ρ· A. Bachmann et al. 1976Zbl. Vet. Med. Β· No. 23:355-363
[0025] 非專利文獻8:病毒實驗學(xué)各論1973國立預(yù)防衛(wèi)生研宄所學(xué)友會?編22-23(々 彳少只実験學(xué)各論1973國立予防衛(wèi)生研宄所學(xué)友會?編22-23)

【發(fā)明內(nèi)容】

[0026] 發(fā)明要解決的問題
[0027] 如上所述，為了進行來源于生物的藥品的病毒安全性評價、應(yīng)用于疫苗生產(chǎn)，期望 生產(chǎn)出高感染滴度的細(xì)小病毒。
[0028] 另外，如上所述的生物制劑的制造工序的病毒清除評價中，也希望生產(chǎn)高感染滴 度的病毒。用于進行該評價的病毒去除濾器的病毒清除試驗，通過將實際生產(chǎn)工序按比 例縮小的模型工序來實施，但是對于該病毒清除試驗所要求的點有：第一，是不產(chǎn)生濾器 的堵塞程度的病毒懸浮液添加量；第二，是表現(xiàn)出評價工序的病毒清除數(shù)值即對數(shù)去除率 (LRV)為4以上的添加量。對于前者，由于包括工序的流速的各參數(shù)必需與實際生產(chǎn)工序相 同（WHO Technical R印ort, Series No. 924, 2004162-165)，所以必須設(shè)為不會因病毒添加 導(dǎo)致堵塞的添加量。因此，期望以體積比計為1%以下、優(yōu)選為0.1%以下進行添加。可以 認(rèn)為，對于后者的LRV為4以上的工序是關(guān)于病毒去除有效地保持耐久性且具有可靠性的 工序（A Robust, effective and reliable process step) (WHO Technical Report, Series No. 924, 2004163-164)，因此需要設(shè)定為能夠表現(xiàn)出4以上作為結(jié)果的病毒添加量。這樣， 作為病毒去除性能需要表現(xiàn)出LRV為4以上，另外，期望向中間產(chǎn)品中添加的病毒懸浮液的 量以體積比計為1 %以下，優(yōu)選為0. 1 %。然而，添加用現(xiàn)有的培養(yǎng)法得到的低感染滴度的 細(xì)小病毒（感染滴度為IO5~10 7TCID5(l/mL，細(xì)小病毒的感染滴度（TCID5cZmL)與雜質(zhì)蛋白 質(zhì)濃度（ng/mL)的比小于10 :1)1%或0. 1%時，由于預(yù)濾器的損失、定量誤差的問題，LRV 難以表現(xiàn)出4以上。此時，為了切實地表現(xiàn)出LRV為4以上，不得不增加病毒添加體積，這 樣一來則存在容易發(fā)生濾器的堵塞等障礙的問題。
[0029] 另外，一直以來，為了解決這樣的問題，可以使用通過銫密度梯度超離心、蔗糖密 度梯度超離心等超離心分離使病毒沉淀而進行濃縮的手法。然而，由于雜質(zhì)也同時被濃縮， 所以存在雜質(zhì)對于實驗的結(jié)果、病毒去除濾器過濾時帶來惡劣影響的問題。
[0030] 另