染滴度的病毒。即，優(yōu)選細(xì)胞培養(yǎng)中得到的病毒的感染滴度高。通過本實(shí)施方式，能夠得到 IO8TCID5ciAiL以上的高感染滴度的細(xì)小病毒溶液，由此在使用了細(xì)小病毒的抗病毒藥研宄 中，能夠稀釋之后作為研宄材料而供給，能夠降低由雜質(zhì)帶來的預(yù)料不到的反應(yīng)、干擾。
[0114] 第二個(gè)用途即為了評價(jià)生物制劑的制造工序的病毒清除而生產(chǎn)病毒的情況下， 也優(yōu)選病毒的感染滴度高。如上所述，該病毒清除試驗(yàn)所要求的點(diǎn)為：第一，是不產(chǎn)生濾 器的堵塞的程度的病毒懸浮液添加量；第二，是評價(jià)的工序的病毒清除數(shù)值即對數(shù)去除率 (LRV)表現(xiàn)出4以上的添加量。為了達(dá)到LRV4以上，不得不向供于病毒去除過濾工序的中 間產(chǎn)品中以使病毒感染化成為IO 4TCID5ciAiL的方式添加病毒，然而實(shí)際上，考慮到病毒感染 化的定量誤差、去除病毒顆粒的締合體的預(yù)濾器中的損失，需要以成為IO 5TCID5ciAiL以上的 方式添加病毒。以體積比計(jì)添加0. 1%，為了達(dá)到IO5TCID5cZmL以上，原先的病毒懸浮液需 要達(dá)到IO 8TCID5ciAiL以上。通過本實(shí)施方式，得到適宜的純度的IO8TCID 5ciAiL以上的高感染 滴度的細(xì)小病毒溶液，由此對各工序的細(xì)小病毒清除進(jìn)行評價(jià)時(shí)，能夠顯著地減少細(xì)小病 毒溶液的添加，能夠消除由來自細(xì)小病毒溶液的雜質(zhì)帶來的濾器的堵塞的問題。
[0115] 另外，第三個(gè)用途，在疫苗生產(chǎn)中，用細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)的病毒的感染滴度高，減輕之 后的病毒疫苗純化工序的負(fù)荷，對于制造是有利的。如果病毒感染滴度低，則雜質(zhì)濃度相對 地變高，所以對純化工序產(chǎn)生負(fù)荷，對于制造是不利的。通過本實(shí)施方式，得到IO 8TCID5tl/ mL以上的高感染滴度的細(xì)小病毒溶液，即便在細(xì)小病毒的疫苗生產(chǎn)中，純化原料中的疫苗 量飛躍地變多，所以能夠更高效且低成本地實(shí)施疫苗純化工序。
[0116] 實(shí)施例
[0117] 以下，基于實(shí)施例、比較例，對于本發(fā)明更詳細(xì)地進(jìn)行說明。需要說明的是，此處所 示的實(shí)施例為代表例，本發(fā)明并不限定于該實(shí)施例。
[0118] [實(shí)施例1]
[0119] 作為豬細(xì)小病毒（PPV)的宿主細(xì)胞使用PK-13細(xì)胞（由ATCC購入），對其用添加 了 10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基（以下，稱為"血清培養(yǎng)基"。后述的實(shí)施例中也同樣。） 在37°C、5% CO2環(huán)境下，使用75cm 2底面積、容量15mL的組織培養(yǎng)用燒瓶（以下，稱為"燒 瓶"。后述的實(shí)施例中也同樣。）進(jìn)行傳代培養(yǎng)。對于該燒瓶內(nèi)的宿主細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)，每24 小時(shí)進(jìn)行測定，測量對數(shù)增殖期的倍增時(shí)間，結(jié)果為17小時(shí)。另外，將成為最多細(xì)胞數(shù)的那 一天和其前后的日子的細(xì)胞數(shù)的平均值作為匯合時(shí)的宿主細(xì)胞的細(xì)胞密度進(jìn)行測量，結(jié)果 為2. OX IO7細(xì)胞/燒瓶。
[0120] 接著，從上述燒瓶剝離PK-13細(xì)胞，向新的燒瓶中，匯合時(shí)的細(xì)胞密度的 1/500 (4. 0 X IO4細(xì)胞 / 燒瓶）、1/200 (I. 0 X 10 5細(xì)胞 / 燒瓶）和 1/40 (5. 0 X 10 5細(xì)胞 / 燒 瓶）的細(xì)胞密度的宿主細(xì)胞與15mL的血清培養(yǎng)基一起進(jìn)行分注。各細(xì)胞密度的條件下各 分注6個(gè)燒瓶。接著，向該各燒瓶中以MOI = 0.01的方式接種PPV，在37°C、5% 0)2環(huán)境 下進(jìn)行培養(yǎng)。在培養(yǎng)容器內(nèi)如上述進(jìn)行感染時(shí)，種病毒在2小時(shí)以內(nèi)感染并被吸入至宿主 細(xì)胞。此時(shí)，一旦細(xì)小病毒從培養(yǎng)液中消失蹤影，則進(jìn)入了所謂的黑暗期（Eclipse)。此時(shí)， 成為一部分細(xì)胞感染了細(xì)小病毒的狀態(tài)。之后，一部分細(xì)胞由于細(xì)小病毒感染而導(dǎo)致死亡， 然而令人吃驚的是，整體的細(xì)胞數(shù)增加了。
[0121] 感染開始后，在培養(yǎng)85小時(shí)（倍增時(shí)間的5倍）、102小時(shí)（倍增時(shí)間的6倍）、 119小時(shí)（倍增時(shí)間的7倍）、136小時(shí)（倍增時(shí)間的8倍）、153小時(shí)（倍增時(shí)間的9倍）、 187小時(shí)（倍增時(shí)間的11倍）的時(shí)間點(diǎn)對于每1個(gè)燒瓶回收培養(yǎng)上清。將回收的培養(yǎng)上清 進(jìn)行3000rpm、20分鐘離心，將上清級分用0. 45 μπι濾器（Nalgene制）進(jìn)行過濾。
[0122] 對于PPV感染滴度，使用96孔板，以利用了紅血球凝集素反應(yīng)的感染判定法，以 TCID5tl法進(jìn)行測定。50%感染滴度的計(jì)算按照Reed-Muench法（醫(yī)科病毒學(xué)、2000.南江 堂.171-172(醫(yī)科學(xué)、2000.南江堂.171-172))進(jìn)行。將其結(jié)果示于表1。如表 1所示，可知得到的病毒的感染滴度為IO 8TCID5cZmL以上的高感染滴度。（表1的數(shù)值將感 染滴度以對數(shù)值表示。例如，8. 1表示108_ 1TCID5tlAiL)。
[0123] 進(jìn)而，對于雜質(zhì)蛋白質(zhì)濃度，用BioRad公司的蛋白質(zhì)分析試劑（考馬斯亮藍(lán)法 (Bradford法））進(jìn)行測定，求出PPV感染滴度（TCID 5Q/mL)與雜質(zhì)蛋白質(zhì)濃度（ng/mL)的 比。將該結(jié)果示于表2。
[0124] [表 1]
[0125] 表1 PK-13感染后的培養(yǎng)上清中PPV滴度（單位：log [TCID5Q/mL])
[01261
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種高感染滴度的細(xì)小病毒的生產(chǎn)方法，其為通過在培養(yǎng)基材中培養(yǎng)宿主細(xì)胞和細(xì) 小病毒的種病毒，從而在培養(yǎng)上清中生產(chǎn)IO 8TCID5ciAiL以上的高感染滴度的細(xì)小病毒的方 法，其包括： 工序（a)，事先分別算出所述培養(yǎng)中的宿主細(xì)胞的對數(shù)增殖期的倍增時(shí)間和匯合增殖 時(shí)的宿主細(xì)胞的細(xì)胞密度； 工序（b)，向包含宿主細(xì)胞和培養(yǎng)基的所述培養(yǎng)基材以感染復(fù)數(shù)即MOI成為0. 0001~ 〇. 1的方式接種細(xì)小病毒的種病毒，所述宿主細(xì)胞的細(xì)胞密度為工序（a)中事先算出的匯 合增殖時(shí)的宿主細(xì)胞的細(xì)胞密度的1/500~1/20 ; 工序（c)，對于工序（b)的包含宿主細(xì)胞和細(xì)小病毒的培養(yǎng)物以工序（a)中事先算出的 倍增時(shí)間的5~11倍的時(shí)間進(jìn)行培養(yǎng)；和 工序（d)，對于包含通過工序（c)的培養(yǎng)而得到的細(xì)小病毒的培養(yǎng)上清進(jìn)行回收。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述宿主細(xì)胞為黏附依賴性細(xì)胞。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，所述宿主細(xì)胞為對細(xì)小病毒具有感受性的細(xì) 胞。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1~3中的任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述細(xì)小病毒為豬細(xì)小病毒即 PPV、犬細(xì)小病毒即CPV、小鼠微小病毒即MVM、大鼠病毒即RV、H-1病毒即H-1、貓細(xì)小病毒 即FPV、鵝細(xì)小病毒即GPV或牛細(xì)小病毒即BPV。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1~4中的任一項(xiàng)所述的方法，其中，在所述工序（b)中，向包含宿主 細(xì)胞和培養(yǎng)基的所述培養(yǎng)基材以感染復(fù)數(shù)即MOI成為0. 0001~0. 1的方式接種所述細(xì)小 病毒的種病毒，所述宿主細(xì)胞的細(xì)胞密度為工序（a)中事先算出的匯合增殖時(shí)的宿主細(xì)胞 的細(xì)胞密度的1/300~1/30。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1~4中的任一項(xiàng)所述的方法，其中，在所述工序（b)中，向包含宿主 細(xì)胞和培養(yǎng)基的所述培養(yǎng)基材以感染復(fù)數(shù)即MOI成為0. 0001~0. 1的方式接種所述細(xì)小 病毒的種病毒，所述宿主細(xì)胞的細(xì)胞密度為工序（a)中事先算出的匯合增殖時(shí)的宿主細(xì)胞 的細(xì)胞密度的1/200~1/40。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1~6中的任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述感染復(fù)數(shù)即MOI為0. 001~ 0. 03〇
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述感染復(fù)數(shù)即MOI為0. 003~0. 01。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1~8中的任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述培養(yǎng)基為血清培養(yǎng)基時(shí)，工 序（c)中包括將該血清培養(yǎng)基更換為無血清培養(yǎng)基的工序。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1~9中的任一項(xiàng)所述的細(xì)小病毒的生產(chǎn)方法，其中，所述工序（c) 中，以工序（a)中事先算出的倍增時(shí)間的6~9倍的時(shí)間進(jìn)行培養(yǎng)。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的細(xì)小病毒的生產(chǎn)方法，其中，所述工序（c)中，以工序（a) 中事先算出的倍增時(shí)間的7~8倍的時(shí)間進(jìn)行培養(yǎng)。
12. 根據(jù)權(quán)利要求1~11中的任一項(xiàng)所述的細(xì)小病毒的生產(chǎn)方法，其中，所述工序（c) 中，對所述培養(yǎng)物在33°C以上且39°C以下的溫度下進(jìn)行培養(yǎng)。
13. 根據(jù)權(quán)利要求1~12中的任一項(xiàng)所述的細(xì)小病毒的生產(chǎn)方法，其中，所述工序（c) 中，所述宿主細(xì)胞與所述病毒同時(shí)進(jìn)行增殖。
14. 根據(jù)權(quán)利要求1~13中的任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述工序（d)中包括以下去除 工序：將所述培養(yǎng)上清所包含的游離的宿主細(xì)胞和宿主細(xì)胞的碎片去除。
15. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中，所述去除工序使用孔徑0. 2 y m~0. 45 y m的 膜過濾來進(jìn)行。
16. -種培養(yǎng)液，其包括通過權(quán)利要求1~15中的任一項(xiàng)所述的方法而得到的 IO8TCID5ciAiL以上的感染滴度的細(xì)小病毒。
17. -種細(xì)小病毒溶液，其是通過細(xì)胞培養(yǎng)而得到的，其包含10 8TCID5tlAiL以上的感染 滴度的細(xì)小病毒并且所述細(xì)小病毒的感染滴度（TCID 5cZmL)與雜質(zhì)蛋白質(zhì)濃度（ng/mL)的 比為 10:1 ~5000:1。
【專利摘要】提供穩(wěn)定且容易地生產(chǎn)高感染滴度的細(xì)小病毒的方法。通過在培養(yǎng)上清中生產(chǎn)108TCID50/mL以上的高感染滴度的細(xì)小病毒的方法從而解決上述問題，所述方法包括以下工序：向包含宿主細(xì)胞和培養(yǎng)基的培養(yǎng)基材以感染復(fù)數(shù)成為0.0001～0.1的方式接種細(xì)小病毒的種病毒，所述宿主細(xì)胞的細(xì)胞密度為匯合增殖時(shí)的細(xì)胞密度的1/500～1/20，以宿主細(xì)胞的倍增時(shí)間的5～11倍的時(shí)間進(jìn)行培養(yǎng)，對于培養(yǎng)上清進(jìn)行回收。
【IPC分類】C12N7-00
【公開號】CN104812893
【申請?zhí)枴緾N201380061077
【發(fā)明人】柳田恒一郎
【申請人】旭化成醫(yī)療株式會社
【公開日】2015年7月29日
【申請日】2013年9月5日
【公告號】EP2924114A1, WO2014080676A1