于向非天然地表達(dá)所述蛋白對的植物細(xì)胞，植物部分 或植物提供該蛋白質(zhì)對，或可用于向植物細(xì)胞，植物部分或植物提供一種以上經(jīng)修飾的底 物蛋白質(zhì)。
[0022] 舉例而言，所述病原體-特異性蛋白酶的底物蛋白質(zhì)可以是來自擬南芥 (Arabidopsis thaliana)的PBSl或RIM同系物，所述NB-LRR蛋白質(zhì)可以是來自擬南 芥的RPS5或RPS2,其中，PBSl或RIM同系物經(jīng)修飾以包含異源蛋白酶識別序列。本領(lǐng) 域技術(shù)人員可以理解，"PBS1"指avrPphB敏感（susceptible) 1。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理 解，"RIN4" 指抗丁香假單胞菌斑點(diǎn)致病變種（Pseudomonas syringae pv.maculicola 1) ("RPM1"）相互作用蛋白質(zhì)4。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，"avrRpt2"指來自丁香假單胞菌 (Pseudomonas syringae)的細(xì)菌無毒性基因，其編碼在植物-丁香假單胞菌相互作用中起 作用的"AvrRpt2"多肽（參見 Innes 等（1993) J. Bacteriol 175:4859-4869)。本領(lǐng)域技術(shù) 人員可以理解，"avrPphB"指來自丁香假單胞菌的細(xì)菌無毒性基因，其編碼在植物-丁香假 單胞菌相互作用中起作用的"AvrPphB"多肽。
[0023] 如上所述，本申請的方法包括向植物細(xì)胞，植物部分或植物引入至少一種本申請 所描述的核酸分子，構(gòu)建體，表達(dá)盒或載體，以賦予其對表達(dá)病原體-特異性蛋白酶的植物 病原體的抗病性。
[0024] 因此，所述的組合物、系統(tǒng)和方法通過向植物細(xì)胞，植物部分或植物轉(zhuǎn)移核苷酸序 列賦予其對植物病原體的抗病性，所述核苷酸序列編碼至少一種病原體-特異性蛋白酶的 經(jīng)修飾底物蛋白質(zhì)，和任選地編碼NB-LRR蛋白質(zhì)（當(dāng)所述NB-LRR蛋白質(zhì)對所述植物細(xì)胞， 植物部分或植物為非天然存在時(shí)）。所述的對經(jīng)工程化以特異于植物病原體-特異性蛋白 酶，所述的工程化通過使經(jīng)修飾的底物蛋白質(zhì)包含植物病原體-特異性蛋白酶的異源蛋白 酶識別序列。當(dāng)被植物病原體-特異性蛋白酶激活后，所述的對啟動包括細(xì)胞程序性死亡 在內(nèi)的宿主防御性應(yīng)答。
[0025] 以下的描述將有助于更好地理解本申請的以上這些以及其他的特征，目的和有益 效果。在所述描述中參照了附圖，其簡述如下。
[0026] 附圖簡述
[0027] 結(jié)合以下詳細(xì)說明，將更容易明白本申請進(jìn)一步的特征，目的和有益效果。所述的 詳細(xì)描述參照以下附圖，其中：
[0028] 圖1是一張照片，其顯示當(dāng)與含AvrRpt2切割位點(diǎn)的經(jīng)修飾的PBS1 (植物 病原體-特異性蛋白酶的底物蛋白質(zhì)）共表達(dá)時(shí)，RPS5(NB-LRR抗病性蛋白質(zhì)）可被 AvrRpt2(植物病原體-特異性蛋白酶）激活。通過注射載有所示核酸分子的根瘤土壤桿菌 (Agrobacterium tumefaciens)，所不核酸分子在粘毛煙草（Nicotiana glutinosa)葉中瞬 時(shí)表達(dá)。各核酸分子在地塞米松-誘導(dǎo)型啟動子的控制之下，在施用地塞米松24小時(shí)后， 對葉拍照。可見的葉萎陷（leaf collapse)顯示細(xì)胞程序性死亡被激活。
[0029] 圖2是圖表，說明從用與圖1所使用的相同菌株接種的粘毛煙草（N. glutinosa) 葉圓盤（leaf disks)的電解液泄漏。電解液泄漏增加表示由于細(xì)胞死亡導(dǎo)致質(zhì)膜喪失完 整性。PBS嚴(yán)2表示其中的AvrPphB (植物病原體-特異性蛋白酶）切割位點(diǎn)（GDKSHVS;SEQ ID N0:1)被 AvrRpt2 切割位點(diǎn)（VPKFGDW;SEQ ID N0:2)替代的 PBS1。
[0030] 圖3是表達(dá)PBS嚴(yán)2( 即，其中的AvrPphB切割位點(diǎn)被AvrRpt2切割位點(diǎn)替代的 PBSl)的轉(zhuǎn)基因擬南芥的被感染葉的照片。示出的是來自右側(cè)接種了丁香假單胞菌菌株 DC3000(AvrRpt2)的五個(gè)不同的初級轉(zhuǎn)化子的葉。照片是在接種后24小時(shí)拍攝的，即未轉(zhuǎn) 化的擬南芥葉不顯示細(xì)胞死亡的時(shí)間點(diǎn)。用于該試驗(yàn)的擬南芥在RIM和RPS2中包含突變， 其避免在不存在經(jīng)修飾的PBSl的情況下由AvrRpt2激活細(xì)胞死亡。
[0031] 圖4是PBS嚴(yán)2構(gòu)建體的示意圖，說明實(shí)施例5中所討論的、RIM切割位點(diǎn)2 (RCS2) 對PBSl激活環(huán)（activation loop)中的AvrPphB切割位點(diǎn)的替換。
[0032] 圖5是誘導(dǎo)后24小時(shí)拍攝的照片，示出PBSIkgs2與AvrRpt2和PRS5的共表達(dá)誘導(dǎo) 了 RPS5-依賴的細(xì)胞死亡應(yīng)答，而如實(shí)施例5中所討論的，在不存在AvrRpt2或PBS嚴(yán)S2時(shí) 沒有檢測到細(xì)胞死亡。
[0033] 圖6是圖表說明如實(shí)施例5中所討論的，PBS嚴(yán)2與AvrRpt2與經(jīng)AvrPphB切割的 野生型PBSl誘導(dǎo)了等量的電解液泄漏，而PBS嚴(yán) S2與C122A僅微弱地激活RPS5。數(shù)據(jù)代表 平均值與標(biāo)準(zhǔn)偏差（η = 4)。
[0034] 圖7是免疫印跡，其確認(rèn)如在實(shí)施例5中所討論的，在誘導(dǎo)后6小時(shí)AvrRpt2切割 了 PBSIkgs2,而 C122A 或 AvrPphB 不然。
[0035] 圖8是照片，其顯示如實(shí)施例5中所討論的，應(yīng)答接種丁香假單胞菌在轉(zhuǎn)基因系2 和5中HR的誘導(dǎo)，而系1和3不然。"Col"表示野生型擬南芥（Arabidopsis)親本。
[0036] 圖9是圖表，其顯示如實(shí)施例5中所討論的，在擬南芥中PBS嚴(yán)S2賦予對 DC3000(avrRpt2)細(xì)菌生長的抗性。數(shù)據(jù)代表平均cfu cm_2(n = 4)，誤差棒表示標(biāo)準(zhǔn)偏差。
[0037] 圖10包含免疫印跡，其顯示如實(shí)施例5中所討論的，與PBS嚴(yán)2表達(dá)相關(guān)的對 DC3000(avrRpt2)細(xì)菌生長的抗性。
[0038] 圖11是免疫印跡，顯示如實(shí)施例5中所討論的，通過由DC3000遞送的AvrRpt2在 轉(zhuǎn)基因擬南芥中表達(dá)的PBS嚴(yán) S2的切割。星號表示C-末端PBSl KS2切割產(chǎn)物的預(yù)期大小。
[0039] 圖12是照片，顯示DC3000 (avrPphB)注射后21小時(shí)PBSIkgs2轉(zhuǎn)基因擬南芥也顯示 HR，如實(shí)施例5中所討論的，證明在這些轉(zhuǎn)基因系中保留了 RPS5的天然識別特異性。
[0040] 圖13描述的是PBSItgs構(gòu)建體，如實(shí)施例5中所討論的，用TEV切割位點(diǎn)替換 AvrPphB切割位點(diǎn)側(cè)翼的7個(gè)氨基酸。
[0041] 圖14包含免疫印跡，顯示如實(shí)施例5中所討論的，由抗-HA(上部的圖）檢測出的 PBSItgs-HA 切割。
[0042] 圖15是本氏煙草（N. benthamiana)的照片，如實(shí)施例5中所討論的、共表達(dá) PBSItgIP TEV蛋白酶激活RPS5。每片葉子的左側(cè)滲入（infiltrated) 了遞送PBSItgs, TEV 蛋白酶和RPS5的土壤桿菌菌株。
[0043] 圖16是說明PBSItgs連同TEV蛋白酶誘導(dǎo)的RPS5-介導(dǎo)的細(xì)胞死亡，所述細(xì)胞死 亡由電解液泄漏表示。如實(shí)施例5中所討論的、所述的電解液泄漏水平與由AvrPphB切割 的野生型PBSl所誘導(dǎo)的電解液泄漏水平類似。數(shù)據(jù)代表平均值與標(biāo)準(zhǔn)偏差（η = 4)。
[0044] 圖17是照片，如實(shí)施例6所討論的，應(yīng)用大豆顯示AvrPphB識別。
[0045] 本發(fā)明可以有多種修飾和替代形式，附圖中以舉例的方式給出了示例性的具體實(shí) 施方案，以下進(jìn)行具體描述。應(yīng)當(dāng)理解，對于示例性【具體實(shí)施方式】的描述并非旨在將本發(fā)明 限定到所公開的特定形式，相反地，其旨在涵蓋落入以上的具體實(shí)施方案以及所附的權(quán)利 要求所定義的、本發(fā)明范圍內(nèi)的全部修飾的、等價(jià)的以及替代形式。因此，應(yīng)參照上述的具 體實(shí)施方案以及后附的權(quán)利要求來解釋本發(fā)明的范圍。
[0046] 發(fā)明詳述
[0047] 以下參照附圖對本發(fā)明的組合物、系統(tǒng)以及方法進(jìn)行更為完整的描述，所述的附 圖中顯示出了本發(fā)明的一些但非全部的具體實(shí)施方案。事實(shí)上，本發(fā)明可以體現(xiàn)為許多中 不同的形式，不應(yīng)被局限于所列出的具體實(shí)施方案，然而，本申請?zhí)峁┝诉@些具體實(shí)施方案 以滿足法律的要求。
[0048] 類似地，得意于體現(xiàn)在上述描述和相關(guān)附圖中的教導(dǎo)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以想到 本發(fā)明適用的、本申請所描述的組合物、系統(tǒng)和方法的多種修飾和其他具體實(shí)施方案。因 此，可以理解本申請不限于所公開的特定具體實(shí)施方案，還有其他的具體實(shí)施方案也落入 后附的權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。盡管本申請中應(yīng)用了特定的術(shù)語，它們僅用于一般性的和描 述性的意義，不是用于限定的目的。