。
[0065] 本申請所用的"嚴(yán)格條件"指在該條件下一種核酸分子可以以比與其他序列可檢 測的更高的程度與其靶雜交（例如至少高于背景2倍）。嚴(yán)格條件可以是序列依賴性的，在 不同的環(huán)境下有所不同。通過控制雜交和/或洗滌條件的嚴(yán)格性，可以鑒定出與核酸分子 100%互補(bǔ)的靶序列（即同源探測）?？晒┻x擇地，可調(diào)整嚴(yán)格條件以允許序列中的一些錯 配，從而檢測較低程度的相似性（即異源探測）。
[0066] 通常，嚴(yán)格條件可以是鹽濃度小于約I. 5M Na+,通常約0.0 lM到1.0 M Na+(或其他 鹽），約pH 7. 0到8. 3,對于短分子（例如10到50個核苷酸）溫度至少約30°C，對于長分 子（例如大于50個核苷酸）至少約60°C。也可以通過添加甲酰胺之類的去穩(wěn)定劑實(shí)現(xiàn)嚴(yán) 格條件。
[0067] 本申請中所用的〃約〃指統(tǒng)計學(xué)意義范圍內(nèi)的值，如所稱的濃度、長度、分子量、 pH、序列同一性、時間范圍、溫度或體積。這種值或范圍可以在一個數(shù)量級的范圍內(nèi)，通常在 給定數(shù)值或范圍的20%以內(nèi)，更通常在10%以內(nèi)，更加通常在5%以內(nèi)。"約"所包含的可 允許的變化依賴于研宄中的具體系統(tǒng)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地理解。
[0068] 示例性的低嚴(yán)格條件包括于約37°C下，在約30%到約35%甲酰胺，IM NaCl, 1% SDS(十二烷基硫酸鈉）的緩沖溶液中雜交，在約50°C到約55°C下，在約IX至2X SSC(20X SSC = 3. OM NaCl/0.3M檸檬酸鈉）中清洗。清洗緩沖液任選地可包含約0.1 %到約1 % SDS0
[0069] 示例性的中等嚴(yán)格條件于約37°C下，在約40%到約45%甲酰胺，1.0 M NaCl, 1% SDS的緩沖溶液中雜交，在約55°C到約60°C下，在約0. 5X至IX SSC中清洗。清洗緩沖液任 選地可包含約0. 1 %到約1% SDS。
[0070] 示例性的高等嚴(yán)格條件于約37°C下，在約50%甲酰胺，IM NaCl, 1% SDS的緩沖 溶液中雜交，在約60°C到約65°C下，在約0.1 X SSC中清洗。清洗緩沖液任選地可包含約 0· 1%到約 1% SDS。
[0071] 雜交過程一般可以是小于約24小時，常為約4到約12小時。清洗過程可以是 至少足以達(dá)到平衡的時間長度。有關(guān)此種條件的其他教導(dǎo)是在本領(lǐng)域容易獲得的，例如 在 Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 3rd ed. (Sambrook&Russell eds. , Cold Spring Harbor Press 2001);以及 Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel 等6(18.，]〇1111町167&3〇118 1995)中。
[0072] 異源病原體-特異性蛋白酶識別序列可以是從約5個氨基酸到約15個氨基酸。植 物病原體-特異性蛋白酶，植物病原體起源，蛋白酶底物蛋白質(zhì)以及內(nèi)源蛋白酶識別序列 的列表示于表1，其可用作異源蛋白酶識別序列資源。
[0073] 表1:植物病原體-特異性蛋白酶，植物病原體起源，蛋白酶底物蛋白質(zhì)和內(nèi)源 蛋白酶識別序列.
[0074]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 重組核酸分子，其包含編碼至少一種具有異源病原體-特異性蛋白酶識別序列的、 植物病原體-特異性蛋白酶的底物蛋白質(zhì)。
2. 權(quán)利要求1的重組核酸分子，其中所述底物蛋白質(zhì)選自AvrPphB敏感I (PBSl)和抗 丁香假單胞菌斑點(diǎn)致病變種I(RPMl)相互作用蛋白質(zhì)4(RIN4)。
3. 權(quán)利要求2的重組核酸分子，其中所述底物蛋白質(zhì)選自擬南芥AvrPphB敏感 I(PBSl)和擬南芥抗丁香假單胞菌斑點(diǎn)致病變種I(RPMl)相互作用蛋白質(zhì)4 (RIM)。
4. 權(quán)利要求1的重組核酸分子，其中所述異源病原體-特異性蛋白酶識別序列為約5 個氨基酸到約15個氨基酸。
5. 權(quán)利要求1的重組核酸分子，其中所述異源病原體-特異性蛋白酶識別序列選自 ⑶KSHVS(SEQ ID NO:1)，VPKFGDW(SEQ ID NO:2) ,QEHGCQL(SEQ ID NO:3) ,ENLYFQG(SEQ ID NO:4)，EPVSTQG(SEQ ID NO: 27)和 PWQAQS (SEQ ID NO: 28)。
6. 權(quán)利要求2的重組核酸分子，其中當(dāng)所述底物蛋白質(zhì)是PBSl時，所述異源病原 體-特異性蛋白酶識別序列位于第約240位氨基酸到第約250位氨基酸之間。
7. 權(quán)利要求2的重組核酸分子，其中當(dāng)所述底物蛋白質(zhì)是RIM時，所述異源病原 體-特異性蛋白酶識別序列位于第約142位氨基酸到第約164位氨基酸之間。
8. 經(jīng)修飾的植物病原體-特異性蛋白酶的底物蛋白質(zhì)，其包含具有異源蛋白酶識別序 列的氨基酸序列，其中所述底物蛋白質(zhì)由權(quán)利要求1的重組核酸分子編碼。
9. 載體，其包含權(quán)利要求1的重組核酸分子。
10. 經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，其包含權(quán)利要求1的重組核酸分子。
11. 權(quán)利要求10的經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，其中所述植物細(xì)胞來自選自單子葉植物和雙子 葉植物的植物。
12. 經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物，其包含權(quán)利要求1的重組核酸分子。
13. 權(quán)利要求12的經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物，其中所述植物選自單子葉植物和雙子葉植物的植 物。
14. 權(quán)利要求12的植物的經(jīng)轉(zhuǎn)化的種子。
15. 保護(hù)植物免受植物病原體感染的方法，所述植物病原體分泌至少一種特異性蛋白 酶，所述方法包含以下步驟： 將編碼至少一種植物病原體-特異性蛋白酶的底物蛋白質(zhì)的核苷酸序列引入所述植 物，所述底物蛋白質(zhì)內(nèi)具有異源病原體-特異性蛋白酶識別序列。
16. 權(quán)利要求15的方法，其中所述底物蛋白質(zhì)選自AvrPphB敏感I (PBSl)和抗丁香假 單胞菌斑點(diǎn)致病變種I(RPMl)相互作用蛋白質(zhì)4 (RIM)。
17. 權(quán)利要求15的方法，其中所述異源病原體-特異性蛋白酶識別序列選自 ⑶KSHVS(SEQ ID NO:1)，VPKFGDW(SEQ ID NO:2) ,QEHGCQL(SEQ ID NO:3) ,ENLYFQG(SEQ ID NO: 4)，EPVSTQG (SEQ ID NO: 27)和 PWQAQS (SEQ ID NO: 28)。
18. 權(quán)利要求15的方法，其中所述核苷酸序列編碼與選自SEQ ID N0:5, SEQ ID N0:6，SEQ ID N0:7和SEQ ID N0:8的氨基酸序列至少90%同一的多肽，其中所述多肽是植 物病原體-特異性蛋白酶的底物蛋白質(zhì)。
19. 重組核酸分子，其包含編碼與選自SEQ ID N0:5，SEQ ID N0:6，SEQ ID N0:7和 SEQ ID N0:8的氨基酸序列至少90%同一的多肽的核苷酸序列，其中所述多肽是植物病原 體-特異性蛋白酶的底物蛋白質(zhì)。
20.由權(quán)利要求19的重組核酸分子編碼的經(jīng)分離的多肽，其包含與選自SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8的氨基酸序列約90%的同一性，其中所述 多肽是植物病原體-特異性蛋白酶的底物蛋白質(zhì)。
【專利摘要】本申請涉及賦予對植物病原體的抗病性的組合物，系統(tǒng)和方法，所述植物病原體利用蛋白酶靶向植物細(xì)胞內(nèi)的植物底物蛋白質(zhì)。簡要地，所述組合物，系統(tǒng)和方法基于被病原體-特異性蛋白酶靶定的底物蛋白質(zhì)，當(dāng)被所述蛋白酶切割時所述底物蛋白質(zhì)激活核苷酸結(jié)合位點(diǎn)-富含亮氨酸重復(fù)(NB-LRR)抗病性蛋白質(zhì)。這些底物蛋白質(zhì)被修飾，以使得內(nèi)源蛋白酶識別序列被特異于不同的病原體蛋白酶的蛋白酶識別序列(即，異源蛋白酶識別序列)替代。所述經(jīng)修飾的植物底物蛋白質(zhì)可與其相應(yīng)的NB-LRR蛋白質(zhì)一起，應(yīng)答異源病原體-特異性蛋白酶的切割，激活抗性。當(dāng)被植物病原體-特異性蛋白酶激活時，所述蛋白質(zhì)對啟動包括細(xì)胞程序性死亡在內(nèi)的宿主防御性應(yīng)答。
【IPC分類】A01H5-00, C12N15-57, C12N15-82
【公開號】CN104812901
【申請?zhí)枴緾N201380058718
【發(fā)明人】R.英尼斯, S.H.金, D.祁
【申請人】美國印第安納大學(xué)研究和技術(shù)公司
【公開日】2015年7月29日
【申請日】2013年9月4日
【公告號】EP2895610A1, US20150247163, WO2014042923A1