一種赤紅球菌及其在制備十溴聯(lián)苯醚降解劑中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物應(yīng)用，具體是涉及一種赤紅球菌及其在制備十溴聯(lián)苯醚降解劑 中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 多溴聯(lián)苯醚（PBDEs)屬于溴系阻燃劑的一種，作為一種添加型阻燃劑，缺少化學(xué) 鍵的束縛，很容易散逸到空氣中，且可隨大氣長距離迀移。PBDEs在外界環(huán)境中難降解，滯留 時(shí)間長，具有強(qiáng)親脂憎水性，可沿食物鏈逐級放大并可在生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)和脂肪組織中 積累。大氣、水體、土壤中的多溴聯(lián)苯醚可通過食物鏈對人類和高級生物的健康構(gòu)成威脅， 也可通過"蚱蜢跳效應(yīng)"廣域迀移，導(dǎo)致全球性污染。研宄證實(shí)，PBDEs可干擾甲狀腺激素， 妨礙人類和動(dòng)物腦部及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育等。
[0003] 十溴聯(lián)苯醚含溴量高，熱穩(wěn)定性好，阻燃效能高，而且產(chǎn)品價(jià)格低，因此它是市場 上需求最大的一類多溴聯(lián)苯醚，廣泛用作耐沖擊性聚苯乙烯、聚酯、聚酰胺、紡織品和電子 產(chǎn)品的添加劑。十溴聯(lián)苯醚釋放到環(huán)境中后，經(jīng)光解、高溫分解、生物及微生物降解等過程， 會(huì)轉(zhuǎn)化為劇毒致癌物多溴二苯并二噁英（PBDDs)、多溴二苯并呋喃（PBDFs)及低溴代聯(lián)苯 醚，這些物質(zhì)更容易進(jìn)入生物體，引起更強(qiáng)的毒害作用。十溴聯(lián)苯醚本身也被測試出具有潛 在的致癌性，并對子代的免疫功能產(chǎn)生影響。
[0004] 多溴聯(lián)苯醚有209種同系物，但商品化的主要有三種：五溴聯(lián)苯醚、八溴聯(lián)苯醚、 十溴聯(lián)苯醚。據(jù)統(tǒng)計(jì)，1999年美國、歐洲、亞洲的多溴聯(lián)苯醚需求量約為67000t，其中十溴 聯(lián)苯醚的需求量占多溴聯(lián)苯醚總需求量的80%以上。隨著五溴聯(lián)苯醚、八溴聯(lián)苯醚在世界 各第被禁止添加于商品中，十溴聯(lián)苯醚的使用量呈現(xiàn)出逐年增加的趨勢。因此，十溴聯(lián)苯醚 所引發(fā)的環(huán)境污染問題及健康毒害問題受到了越來越多的學(xué)者的關(guān)注，必須發(fā)掘高效、安 全降解十溴聯(lián)苯的方法。
[0005] 微生物好氧降解是利用自然界中存在的微生物分解物質(zhì)，具有高效、時(shí)間短、二 次污染少、投資少等特定。目前報(bào)道的具有十溴聯(lián)苯醚降解能力的菌株包括有Whiterot fungi,RhodococcusjostiiRHA1 和BurkholderiaxenovoransLB400,Lysinibacillus fusiformisDB-1等，但是他們降解十溴聯(lián)苯醚的效率低，功能不強(qiáng)。因此，發(fā)掘可以高效、 安全降解十溴聯(lián)苯醚的功能菌株對于十溴聯(lián)苯醚污染治理具有重要意義。
[0006] 目前，紅球菌屬已有報(bào)道，但經(jīng)16SrRNA序列同源性分析，在本發(fā)明中的一株十溴 聯(lián)苯醚降解菌（Rhodococcusruber)也屬于紅球菌屬，但與之前報(bào)道中的屬于不同種。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種赤紅球菌（Rhodococcusruber)TAW-CT127。
[0008] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種赤紅球菌（Rhodococcusruber)TAW-CT127在制 備十溴聯(lián)苯醚降解劑中的應(yīng)用。
[0009] 所述赤紅球菌（Rhodococcusruber)TAW-CT127,已于2015年4月8日保藏于中國 典型培養(yǎng)物保藏中心，地址：中國武漢武漢大學(xué)，郵編：430072,保藏中心保藏編號為CCTCC NO.M2015212。
[0010] 赤紅球菌（Rhodococcusruber)TAW-CT127由采集福建廈門同安灣附近海 域表層沉積物（E118° 10'，N24° 39')中分離篩選出，該菌株屬于諾卡氏菌科 (Nocardiaceae)，通過赤紅球菌（Rhodococcusruber)TAW-CT127對十漠聯(lián)苯釀的降解作用 的研宄，證明赤紅球菌（Rhodococcusruber)TAW-CT127可在制備十溴聯(lián)苯醚降解劑中的應(yīng) 用。
[0011] 赤紅球菌（Rhodococcusruber)TAW-CT127的富集篩選采用等濃度添加污染 物作為其生長的唯一碳源，在人工海水培養(yǎng)基MMC(NaCl24g/L，NH4N03lg/L，KCl0. 7g/ L，KH2P042.0g/L，Na2HP043.0g/L，pH7.4,MgS047g/L)中加入十溴聯(lián)苯醚-二氯甲烷溶 液及微量元素（CaCl2mg/L，F(xiàn)eCl3 ? 6H20 50mg/L，CuS040. 5mg/L，MnCl2 ? ?H20 0? 5mg/L， ZnS04 ? ? 7H20lOmg/L)，十溴聯(lián)苯醚濃度為100mg/L，pH7. 4。該菌落為圓形，邊緣規(guī)則整齊， 粉紅色，光滑，濕潤，凸起；菌體呈微桿狀，革蘭氏染色陰性。
[0012] 采用由赤紅球菌（Rhodococcusruber)TAW-CT127制備的十溴聯(lián)苯醚降解劑的降 解方法為：將赤紅球菌（Rhodococcusruber)TAW-CT127接種于十溴聯(lián)苯醚為唯一碳源的 液體培養(yǎng)基中，避光條件下置于搖床中富集培養(yǎng)。
[0013] 降解條件為pH7. 4,溫度為28°C，搖床的轉(zhuǎn)動(dòng)速率為160rpm。
[0014] 十溴聯(lián)苯醚降解培養(yǎng)基中十溴聯(lián)苯醚為唯一碳源。
[0015] 培養(yǎng)物經(jīng)GC-MSD測定，可分析赤紅球菌（Rhodococcusruber)TAW-CT127對十溴 聯(lián)苯醚的降解效果，在以十溴聯(lián)苯醚為唯一碳源的情況下，該菌株對十溴聯(lián)苯醚具有一定 的降解作用。
[0016] 本發(fā)明的有益效果是：
[0017]本發(fā)明的赤紅球菌（Rhodococcusruber)TAW-CT127在pH7.4,28°C，搖床的轉(zhuǎn)動(dòng) 頻率為160rpm，在以十溴聯(lián)苯醚為唯一碳源的降解培養(yǎng)基中培養(yǎng)8天，該菌對十溴聯(lián)苯醚 的降解率達(dá)到91%。
【附圖說明】
[0018] 圖1為基于TAW-CT127菌株的16SrRNA序列所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹。
[0019] 圖2為BDE-209甲苯-異辛烷混合溶液（v/v= 1 : 9)標(biāo)準(zhǔn)溶液總離子流色譜圖。
[0020] 圖 3 為BDE-209 特征圖譜（m/z)。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制于本發(fā)明的保護(hù)范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù) 人員可以對本發(fā)明做各種改動(dòng)和修改，這些等價(jià)形式同樣落入本申請的保護(hù)范圍。
[0022] 實(shí)施例一
[0023] 一、赤紅球菌（Rhodococcusruber)TAW-CT127的富集、分離和鑒定
[0024] 1、赤紅球菌（Rhodococcusruber)TAW-CT127 富集、分離和純化 [0025]培養(yǎng)基：
[0026] 人工海水培養(yǎng)基（MMC):每升培養(yǎng)基中含有NaCl 24g，NH4N03lg，KC1 0. 7g， KH2P042. 0g，Na2HP043. 0g，pH 7. 4, MgS047g(滅菌后加入）。
[0027] 微量元素鹽溶液：每升微量元素鹽溶液中含有CaCl 2mg，F(xiàn)eCl3*6H20 50mg， CuS040. 5mg，MnCl2 ? ? H20 0? 5mg，ZnS04 ? ? 7H20 10mg。
[0028] 海生菌瓊脂2216培養(yǎng)基和海生菌肉湯2216培養(yǎng)基購買于碧迪醫(yī)療器械（上海） 有限公司。
[0029] 十溴聯(lián)苯醚母液：有機(jī)溶劑二氯甲烷（色譜級），十溴聯(lián)苯醚濃度lg/L
[0030] 本發(fā)明的赤紅球菌（Rhodococcusruber)TAW-CT127是從福建廈門同安灣附近海 域表層沉積物物經(jīng)富集、分離、純化而得。
[0031] 樣品富集及單菌株分離純化方法：取3~5g沉積物樣品添加于含有100mL培養(yǎng) 基（人工海水培養(yǎng)基+微量元素鹽溶液）的250mL的三角燒瓶中，加入十溴聯(lián)苯醚作為菌 株生長所需要的唯一碳源，濃度為l〇〇mg/L。把三角燒瓶用錫箔紙做避光處理，置于28°C、 160rpm搖床中震蕩培養(yǎng)。震蕩培養(yǎng)分4個(gè)階段，每階段的時(shí)間為4w，四個(gè)階段的不同之處 為在第一階段的富集培養(yǎng)基中加入5mL海生菌肉湯2216培養(yǎng)基，為菌體生長提供豐富的 營養(yǎng)物質(zhì)，而第二、三、四階段未添加該培養(yǎng)基。取lmL上一階段的富集培養(yǎng)液作為下一階 段的菌種來源接種到新的培養(yǎng)基中。待第四階段富集培養(yǎng)結(jié)束后，取lmL第四階段的富集 培養(yǎng)液，用無菌超純水進(jìn)性10倍梯度稀釋，然后取1〇_5_1〇_ 7倍的稀釋液涂布于海生菌瓊脂 2216E平板培養(yǎng)基上。涂布后的平板置于28°C恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)5天，從平板上挑出 不同形態(tài)的單菌落，在海生菌瓊脂2216十溴聯(lián)苯醚平板培養(yǎng)基上劃線純化，收集部分菌體 用于提取DNA，同時(shí)保藏菌種。
[0032] 赤紅球菌（Rhodococcusruber)TAW-CT127的獲得：100mL培養(yǎng)基（人工海水培養(yǎng) 基+微量元素鹽溶液），以十溴聯(lián)苯醚（50mg/L)為唯一碳源的培養(yǎng)基作為實(shí)驗(yàn)組，不加十溴 聯(lián)苯醚的培養(yǎng)基作為對照組，實(shí)驗(yàn)組和對照組設(shè)立三個(gè)重復(fù)組。接入純化后的單菌株，使培 養(yǎng)基的0D600值在0. 23~0. 25范圍內(nèi)。將接種后的實(shí)驗(yàn)組和對照組置于28°C、160rpm的 搖床中震蕩培養(yǎng)（培養(yǎng)基做避光處理）。培養(yǎng)5d后，取富集培養(yǎng)液，0D600條件下測得吸光 值。且通過肉眼觀察最終獲得十溴聯(lián)苯醚降解菌株赤紅球菌，實(shí)驗(yàn)中的編號為TAW-CT127。
[0033] 2、菌株的鑒定
[0034] (1)菌體及菌落的形態(tài)特征：
[0035] 采用常規(guī)的細(xì)菌生理生化鑒定方法和電子顯微鏡觀察，赤紅球菌的細(xì)胞為革蘭氏 陰性，在2216E固體平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)48h，菌落形態(tài)為圓形，邊緣整齊，粉紅色，光滑，濕 潤，凸起，菌落直徑為〇. 5毫米。
[0036] (2)菌體的遺傳特征：
[0037]通過對赤紅球菌（Rhodococcusruber)TAW-CT127 的 16SrRNA序列測定和 在Ez-biocloud網(wǎng)站上進(jìn)行同源性分析，該序列與模式菌株RhodococcusruberDSM 43338(T)X80625的16SrRNA序列的同源性達(dá)到100%。根據(jù)菌株命名法則，該十溴聯(lián)苯醚 降解菌株被命名為赤紅球菌（Rhodococcusruber)TAW-CT127?；诔嗉t球菌（Rhodococcus ruber)TAW-CT127的16SrRNA序列所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹（如圖1)其16SrRNA序列如下：
[0038] 1 TCCTGGCTCA GGACGAACGC TGGCGGCGTG CTTAACACAT GCAAGTCGAA 51 CGATGAAGCC CAGCTTGCTG GGTGGATTAG TGGCGAACGG GTGAGT