一種無血清人的外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種生物制劑，尤其涉及一種淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著細(xì)胞遺傳學(xué)的發(fā)展，外周血淋巴細(xì)胞染色體核型分析已成為產(chǎn)前診斷的常規(guī) 檢測項(xiàng)目。淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基作為此檢測項(xiàng)目的主要材料，其產(chǎn)品質(zhì)量水平直接影響檢測的 成功率和準(zhǔn)確性。常規(guī)的外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基是在基礎(chǔ)培養(yǎng)基（如RPMI1640)的基礎(chǔ) 上添加一定量的動物血清（如牛血清），作為提供細(xì)胞生長、增殖所必需的物質(zhì)。但利用動 物血清的缺點(diǎn)也很明顯：由于血清成分復(fù)雜，不僅有促生長物質(zhì)，還含有潛在的生長抑制物 質(zhì)；且不同批次的血清存在的質(zhì)量波動，造成培養(yǎng)基細(xì)胞培養(yǎng)效果的批間差異。
[0003] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于現(xiàn)有外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基大多采用動物或人 的血清作為添加物，不僅成本較高，而且增加了傳播疾病的風(fēng)險，同時不同批次間存在質(zhì)量 差異的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明提供一種優(yōu)化的無血清組成的外周血淋巴細(xì)胞 培養(yǎng)基，用于染色體核型分析，具有成本低廉、質(zhì)量穩(wěn)定、培養(yǎng)效果佳的優(yōu)點(diǎn)。
[0005] 本發(fā)明提供一種無血清人的外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基，包括凝集素、基礎(chǔ)培養(yǎng)基以 及血清替代物，所述凝集素為L型植物血球凝集素，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為RPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng) 基，所述血清替代物包括牛血清白蛋白、重組人胰島素、檸檬酸鐵和氨基酸母液。
[0006] 優(yōu)選地，本發(fā)明的無血清人的外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基，包括如下組分：RPMI1640 培養(yǎng)基干粉10. 4g/L，碳酸氫鈉2.Og/L，牛血清白蛋白4.Og/L，L型植物血球凝集素20mg/L，氨基酸母液20ml/L，檸檬酸鐵lmg/L，重組人胰島素10mg/L。
[0007] 優(yōu)選地，本發(fā)明的無血清人的外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基，所述氨基酸母液包括L-谷 氨酸、L-甘氨酸和L-天冬氨酸。
[0008] 優(yōu)選地，本發(fā)明的無血清人的外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基，氨基酸母液中L-谷氨酸的 濃度為300mg/L，L-甘氨酸的濃度為100mg/L，L-天冬氨酸的濃度為400mg/L。
[0009] 優(yōu)選地，本發(fā)明的無血清人的外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基，所述牛血清白蛋白的純度 不低于98%。
[0010] 優(yōu)選地，本發(fā)明的無血清人的外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基，所述L型植物血球凝集素 (PHA-L)為來自紅腰子豆的具有刺激T淋巴細(xì)胞有絲分裂的凝集素類糖蛋白組分。
[0011] 優(yōu)選地，本發(fā)明的無血清人的外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基，所述L型植物血球凝集素 (PHA-L)的純度不小于95%。
[0012] 本案中所用的植物血球凝集素（Phytohemagglutinin，PHA)為存在于紅腰子豆 (Phaseolusvulgaris)的植物類凝集素。與由同種亞基組成的凝集素如ConA不同，PHA由 兩種不同亞基組成的凝集素。其亞基可以分為PHA-E和PHA-L兩類，其中PHA-E型亞基具 有較為顯著的凝集紅細(xì)胞功能而無淋巴細(xì)胞刺激活性，而PHA-L型亞基則具有較為顯著的 刺激淋巴細(xì)胞增殖的功能。
[0013] 優(yōu)選地，本發(fā)明的無血清人的外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基，所述重組人胰島素是使用 酵母或大腸桿菌為工程菌生產(chǎn)出來的藥用級的胰島素。
[0014] 本發(fā)明專利申請中涉及的制劑除特殊說明均可以從市面購買，特此說明。
[0015] 本發(fā)明的無血清人的外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基采用血清替代物替代傳統(tǒng)使用的動 物或人血清，這樣可以不僅可以降低培養(yǎng)基成本，還可以降低傳播疾病的風(fēng)險；本發(fā)明的 無血清人的外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基所用組分確定，避免了傳統(tǒng)血清成分復(fù)雜，不同批次間 具有質(zhì)量差異，而導(dǎo)致培養(yǎng)效果波動的問題；本發(fā)明提供的細(xì)胞培養(yǎng)基淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)換率與 淋巴細(xì)胞分裂指數(shù)高，試劑成本低、質(zhì)量穩(wěn)定，培養(yǎng)的細(xì)胞可用于染色體核型分析的臨床診 斷。
【附圖說明】
[0016] 利用附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但附圖中的內(nèi)容不構(gòu)成對本發(fā)明的任何限 制。
[0017] 圖1是PHA提取物和純化的PHA-L電泳檢測結(jié)果，其中1 :PHA粗制品；2 :PHA-L; 3 :蛋白分子Markers。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 結(jié)合以下實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步描述。
[0019] 本發(fā)明提供一種無血清人的外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基，包括凝集素、基礎(chǔ)培養(yǎng)基以 及血清替代物，所述凝集素為L型植物血球凝集素，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為RPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng) 基，所述血清替代物包括牛血清白蛋白、重組人胰島素、檸檬酸鐵和氨基酸母液。
[0020] 本發(fā)明的無血清人的外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基，所用牛血清白蛋白的純度不低于 98%。所用L型植物血球凝集素（PHA-L)為來自紅腰子豆的具有刺激T淋巴細(xì)胞有絲分裂 的凝集素類糖蛋白組分，純度不小于95%。所述重組人胰島素是使用酵母或大腸桿菌為工 程菌生產(chǎn)出來的藥用級的胰島素。
[0021] 實(shí)施例一
[0022] (一）50X氨基酸母液的配制
[0023] 所用L型氨基酸皆來自國藥集團(tuán)（BR級），1L氨基酸母液具體配制如下：
[0024] 分別稱量L-谷氨酸300mg、L-甘氨酸100mg、L-天冬氨酸400mg，加入500mL超純 水中，攪拌均勻，加超純水定容至l〇〇〇mL，混勻后分裝，于4°C貯存?zhèn)溆谩?br>[0025](二）PHA-L的制備方法
[0026] (1)PHA粗提物提取：
[0027]1?材料：紅腰子豆（新鮮，無發(fā)霉，色澤鮮明）。
[0028] 2.將檢驗(yàn)合格的紅腰子豆粉碎，過100目篩網(wǎng)，制成紅腰子豆豆粉。取一定量的紅 腰子豆豆粉，用倍量的生理鹽水浸泡，置冰箱內(nèi)浸泡12小時。將樣品離心（20°C、lOOOOrpm、 15min)，收集上清。將上清加乙醇至30%，置冰箱內(nèi)12小時。離心，棄去上清，沉淀用4#漏 斗過濾，取沉淀置4°C冰箱12小時。沉淀中加入乙醇、乙醚，使溶液乙醇濃度達(dá)到70%，置 4°C冰箱12小時。棄去上清，沉淀離心，用乙醇洗滌，離心，取沉淀。樣品置-20°C冰箱預(yù)冷lh，凍干，樣品存于4°C冰箱保存，備用。
[0029] (2)PHA_L的純化：
[0030] 采用陰離子交換層析方法對PHA進(jìn)行分離，方法如下：以15mmolNa2HP04(pH6. 5) 溶液平衡DEAE-